| 研究課題/領域番号 |
18K09406
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| 研究機関 | 大阪大学 |
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研究代表者 |
松下 賢治 大阪大学, 医学系研究科, 講師 (40437405)
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| 研究分担者 |
國吉 一樹 近畿大学, 医学部, 講師 (30234470)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | シナプトジェネシス / ライブイメージング / アストロサイト |
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| 研究実績の概要 |
検査システムの構築で網膜のOFF反応を非侵襲的に検出する網膜電図を完成しPure S coneの単離を行なった。次いで、生体におけるシナプス再形成（シナプトジェネシス）の経時的形態変化を観察するため、二光子励起顕微鏡による網膜内層観察を行った。1）眼球断面のライブイメージング用に緑内障モデルをOVD Induce-OHモデルとして作成した。このモデルでは眼圧（IOP）が注射後1時間で急速に上昇し、少なくとも6時間は維持することを確認した。1日後、反対眼と高眼圧（OH）眼の間に有意差は無かった。複数の生体染色（ヘキストー核、FITC-デキストランー血管、およびスルフォローダミンーアストロサイト）を用いた。 880 nmからの励起を適用して、417～612 nmの範囲の蛍光をモニターし、自己蛍光およびセカンドハーモニックによって組織輪郭を取得しイメージング領域の認識を補完した。 2）シナプトジェネシスに影響するアストロサイトの形態変化を観察した。眼圧上昇によってアストロサイトが互いに分離し、細胞の重なり合う領域が減少し、そのプロセスが薄くなり伸長することが観察された。ビスコート注射後1時間、網膜中心部のアストロサイトは引き離されているように見え、細胞分布はより均一に見えた。数時間IOPが着実に増加した後、OH眼のアストロサイトはかなりの部分で反対眼よりも明らかに蛍光強度が弱かった。注射後11日目に、OH眼の網膜全体の山のいくつかのファイルは小さなビットまたはスポットでいっぱいであり、網膜中心部のアストロサイトはぼやけているか、形態を失っていたが、ぼやけたアストロサイトは末梢ゾーンに存在しなかった。このアストロサイトの形態変化は、OH眼の網膜の中心部から始まり、徐々に末梢に広がったと考えられた。これらの知見は、アストロサイトの活性化前の移行状態を明らかにしている可能性がある。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
検査システムの構築で網膜のOFF反応を非侵襲的に検出する方法である網膜電図を完成しPure S coneの単離を行なった。次いで、Necl-1のシナプスにおける役割を観察することで、生体におけるシナプス再形成（シナプトジェネシス）の経時的形態変化を観察し、緑内障病態に関与する分子機構を解明するため、二光子励起顕微鏡による網膜内層観察を試験的に行った。複数の生体染色（ヘキストー核、FITC-デキストランー血管、およびスルフォローダミンーアストロサイト）と自己蛍光およびセカンドハーモニックによってイメージング領域を認識できた。偶然、アストロサイトの形態変化を検出し、高眼圧負荷との関連を観察できた。
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| 今後の研究の推進方策 |
来年度は、NeclにGFPを繋げたEGFP-NeclマウスをCRISPR/CAS9(大阪大学医学部ゲノム編集室)にて作成し、そのモデルとGFAP-eGFPマウスのOH誘発緑内障モデルを用いて、二光子顕微鏡でライブイメージングを観察する。さらに、EGFP-Neclマウスを用いたシナプトジェネシス観察を、これまで開発してきたOFF反応解析網膜電図と二光子励起顕微鏡による網膜内層（IPL層）観察にて生体におけるシナプス再形成（シナプトジェネシス）の経時的形態変化を観察し、その病態に関与する分子機構（その他のIgG superfamilyとの関連性を含む）を解明する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
旅費計上が減少したため
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