| 研究課題/領域番号 |
18K09432
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| 研究機関 | 独立行政法人国立病院機構(東京医療センター臨床研究センター) |
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研究代表者 |
岡本 晶子 (須賀) 独立行政法人国立病院機構(東京医療センター臨床研究センター), 分子細胞生物学研究部, 研究員 (70450400)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | 遺伝性疾患 / 機能解析 / シナプス / モデル動物 / ゲノム編集 / 分子生物学 |
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| 研究実績の概要 |
本研究は、優性遺伝性黄斑変性の日本人家系から同定した新規原因遺伝子LRRTM4の変異について、変異マウスの病態と変異タンパク質の機能的変化を検討するものである。
LRRTM4は1回膜貫通型のシナプス分子として知られており、シナプス形成を促進する機能が知られている。他の網膜変性疾患及び機能不全の原因遺伝子として同定されているシナプス分子の欠損マウスでは視細胞と双極細胞の間のリボンシナプスの形態に異常が見られることが多いため、LRRTM4の変異も視細胞と双極細胞の間のシナプス形成に影響すると予想される。平成30年度は、Lrrtm4 にヒトと同一のアミノ酸変異を持つマウスの網膜層構造を網膜断層像撮影によって経時的に観察し野生型マウスと比較した。また、LRRTM4タンパク質を発現するコンストラクトを作製し、細胞内局在と複合体形成について検討した。LRRTM4タンパク質にはC末端側の配列が異なるshort isoform（S型）とlong isoform（L型）があり、上記変異はL型のみに含まれる配列に位置する。しかし現在市販されている抗体ではS型とL型を区別できないため、L型特異的に認識する抗体を外部受託により作成した。
変異モデルマウスを用いた実験では、通常飼育下では変異マウスと野生型マウスの間に顕著な差は見られなかったが、強い光を当てた条件下では変異マウスは野生型マウスに比べて視細胞層の減少が見られた。またLRRTM4の機能解析では、LRRTM4タンパク質がホモ複合体を形成することが示された。L型特異的抗体はin vitroにおいてLRRTM4のL型アイソフォームのみを認識することを確認した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
Lrrtm4変異マウスはCRISPR/Cas9法を用いて患者と同じ1アミノ酸置換を持つマウスを作出した。本変異が黄斑変性の患者から同定されたことから、変異マウスでは視細胞変性が見られることが期待された。変異ヘテロマウス、変異ホモマウスは、通常飼育下で1年齢までの観察では野生型マウスと比較して視細胞層の顕著な減少は見られなかった。しかし、8週齢～10週齢のマウスに対してLEDライトを用いて3000lxの白色光を1時間照射した条件では、光照射1週間後に野生型マウスに対して優位に視細胞層の厚さが減少する結果が得られた。免疫組織染色によりマウス網膜組織で視細胞の核の数が減少していること、桿体視細胞と錐体視細胞の外節が消失していることを確認した。また視細胞が変性した領域では双極細胞の末端の形に変化が見られた。上記結果は変異マウスでは視細胞が光に対して脆弱なことを示唆している。
In vitroの検討では、免疫沈降実験によりLRRTM4タンパク質がホモ複合体を形成すること。L型とS型のアイソフォーム間でも複合体を形成することを確認した。野生型タンパク質と変異タンパク質の間で複合体形成効率に差がある傾向が見られた。LRRTM4の細胞内局在を調べるためにプラスミドベクターを用いてLRRTM4を過剰発現させたHEK293T細胞、COS7細胞に対して免疫細胞染色を行った結果、L型に対してS型のタンパク質の方が細胞膜に局在する傾向があった。L型タンパク質はゴルジ体に強く局在したが、野生型と変異型タンパク質の間に局在の顕著な差は見られなかった。L型タンパク質を特異的に認識する抗体を作製するため、L型特異的なペプチド配列を用いてウサギに対して免疫しポリクローナル抗体を得た。同抗体はin vitroで発現させたタンパク質についてはL型のみを認識した。
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| 今後の研究の推進方策 |
変異マウスを用いたin vivo実験では、変異マウスは野生型に対して光刺激に対して脆弱なことが示唆された。通常飼育条件では変性は見られなかったが、遺伝子変異により視細胞と双極細胞の間のシナプス結合に何らかの影響があると予想されるため、双極細胞のマーカーとシナプス分子の局在を免疫組織染色により詳細に検討する。また、LRRTM4は1回膜貫通型シナプス分子であるため、細胞膜に局在して機能すると考えられる。免疫細胞染色に加えて細胞分画を用いて細胞膜への局在に関して野生型と変異体の間に差があるかどうかを検討する。また各ドメインの欠失コンストラクトを用いて複合体形成に必要な領域を調べる。Lrrtm4の網膜内での局在をmRNAレベルおよびタンパク質レベルで確認するために、L型とS型特異的なRNAプローブを用いたin situ hybridizationおよびL型特異的認識抗体を用いた免疫組織染色を行う。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
抗体の受託生産について、別に獲得した外部資金を充てたため次年度使用額が生じた。本所助成金については光照射実験中にマウスの行動を記録するシステムを導入予定であり、その購入に充てる。
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