| 研究課題/領域番号 |
18K09432
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| 研究機関 | 独立行政法人国立病院機構(東京医療センター臨床研究センター) |
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研究代表者 |
岡本 晶子 (須賀) 独立行政法人国立病院機構(東京医療センター臨床研究センター), 分子細胞生物学研究部, 研究員 (70450400)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | 遺伝性網膜疾患 / 動物モデル / 病態解析 / 全ゲノム配列解析 |
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| 研究実績の概要 |
本研究は、顕性遺伝を示す黄斑変性の日本人家系から全エクソン配列解析によって同定した新規原因遺伝子候補LRRTM4 C538Y変異について、変異ノックインマウスの病態と変異タンパク質の機能的変化を検討するものである。これまでにin vitroでのタンパク質発現量及び局在の解析、C538Y変異ノックインマウスの表現型の解析を行った。In vitroでは、LRRTM4 C538Y変異タンパク質は野生型と比較すると細胞内小器官のゴルジ体に強く局在が見られる事、N末端のシグナルペプチドが切断された成熟型と考えられるタンパク質の量が少ないことが示された。LRRTM4がシナプスに局在する膜タンパクであることから、C538Y変異によって膜に局在するLRRTM4タンパク質量が減っていると予想された。しかしながら、C538Y変異ノックインマウスの表現型を検討したところ、野生型に対して変異ヘテロマウス、変異ホモマウスどちらも網膜層構造、視細胞の電気生理的な反応の大きな差は見られず、マウスにおいてはこの変異のみではヒト患者で見られるような10代からの顕著な黄斑変性と双極細胞の応答低下は確認できなかった。本変異を疾患原因候補とする過程では、公開データでの変異頻度およびin-houseデータで健常者には見られない希少変異であることを確認し、またシナプス後膜に局在する神経機能に影響する可能性の高い分子であることを参考にした。しかしマウスでヒトに類似する表現型が確認できない点から、本変異以外に黄斑変性の原因となる遺伝的変化がエクソン外領域に存在する可能性が考えられる。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
本研究で対象としているLRRTM4 C538Y変異は、顕性黄斑変性家系の全エクソン配列解析の結果患者のみで見られる希少変異として同定された。in vitroでのLRRTM4野生型タンパク質と変異体タンパク質の発現量、局在比較では変異体タンパク質の翻訳後修飾と細胞内局在に変化が見られた。しかし、LRRTM4 C538Y変異をもつノックイン（KI）マウスはKIホモ、ヘテロとも生後1年間まで網膜層構造と網膜電図の変化は観察されなかった。またアミノ酸配列の変化を伴う塩基配列がmRNAのスプライシングに影響する可能性も考え、KIマウス網膜でLRRTM4のアイソフォームを区別するRT-PCRを行ったが、各アイソフォームの発現量に野生型とKIマウスの間で差は見られなかった。上記変異ではなくエクソン外の配列置換又は構造変異が患者の発症原因となっている可能性を考え、患者ゲノムDNAから改めて全ゲノム配列解析を行い、まず塩基置換によるスプライシング異常の可能性を検討したが、黄斑変性の原因遺伝子内に患者のみで見られるエクソン外塩基置換は見られなかった。
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| 今後の研究の推進方策 |
これまでの実験結果から、当初遺伝学的に顕性黄斑変性の原因と考えられたLRRTM4 C538Y変異は少なくともマウスで患者同様の病態を惹起する原因とはなっていない。今後は全エクソン配列解析で検出されない変異が真の原因となっている可能性をさらに検討するため、昨年度行った全ゲノム配列解析の結果から新規原因遺伝子のスプライシング異常が原因となっている可能性をより詳細に検討する。また、塩基置換もしくは短い欠損・挿入の他に、より大きなゲノムの構造変異を検出するために用いられている解析パイプラインの利用を進める。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
全ゲノム配列解析の費用は昨年度の時点で支出した。リードの解析は研究室自前のパイプラインおよびフリーソフト（Splice AI）を利用したので費用が抑えられた。
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