| 研究課題/領域番号 |
18K09446
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| 研究機関 | 大阪大学 |
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研究代表者 |
川崎 諭 大阪大学, 医学系研究科, 特任准教授(常勤) (60347458)
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| 研究分担者 |
辻川 元一 大阪大学, 医学系研究科, 教授 (70419472)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | タイトジャンクション / クローディン / 膠様滴状角膜ジストロフィ |
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| 研究実績の概要 |
膠様滴状角膜ジストロフィ(GDLD)はTACSTD2遺伝子の変異により角膜上皮バリア機能が低下して角膜組織にアミロイドが沈着する遺伝性角膜疾患であり、患者の多くは著明な視力低下に苦しんでいる。TACSTD2は定常状態ではCLDN1および7の際限のない多量体形成を抑えて適切なタイトジャンクション形成を導いており、病的状態であるGDLDにおいては、その制御が効かないためにCLDN分子の凝集が生じてタイトジャンクション機能が低下すると考えている。
GDLDのモデル細胞を用いて、TACSTD2タンパクの有無がCLDN1および7の局在に影響することを確認した。また細胞内部に局在するCLDN1および7タンパクは凝集体の様相を示しており、Blue Native PAGEを用いて検討したところ、CLDN7タンパクはTACSTD2タンパクが存在しない状況では高分子域に泳動され、TACSTD2タンパクが存在しない状況では低分子域に泳動された。 このことはTACSTD2タンパクが存在しない状況ではCLDN7が多量体を形成していることを示唆した。
またGDLD患者でこれまでに発見されたミスセンス変異によるGDLD発症のメカ ニズムについても検討したところ、ミスセンス変異によってTACSTD2は本来局在すべき細胞膜に局在せず、またグリコシレーションについても異常なパターンを示した。このことはミスセンス変異によってTACSTD2タンパクが小胞体内部においてフォールディングエラーを生じ、ERAD （EndoplasmicReticulum-Associated Degradation）の経路によって分解される可能性が示唆された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
HeLa細胞にCLDN1および7遺伝子を強制導入し、テトラサイクリン誘導下にTACSTD2遺伝子を発現するGDLDのモデル細胞を構築した。テトラサイクリン添加によってTACSTD2遺伝子の発現を誘導するとCLDN1およびCLDN7タンパクが細胞内部の核周囲から細胞膜へと移動することが観察され、TACSTD2タンパクの有無がCLDN1および7の局在に影響することが確認された。また細胞内部に局在するCLDN1および7タンパクは凝集体の様相を示した。このGDLD病態モデル細胞を用いて、TACSTD2タンパクの存在の有無によってCLDN7タンパクの状態がどのように変化するかについてBlue Native PAGEを用いて検討したところ、CLDN7タンパクはTACSTD2タンパクが存在しない状況では高分子域に泳動され、TACSTD2タンパクが存在しない状況では低分子域に泳動された。 このことはTACSTD2タンパクが存在しない状況ではCLDN7が多量体を形成していることを示唆した。また我々はGDLDのモデル細胞として、不死化ヒト角膜上皮細胞（HCE-T細胞）からGDLDの責任遺伝子であるTACSTD2とそのパラログ遺伝子であるEpCAM遺伝子をダブルノックアウトした細胞 を作製した。この細胞はGDLDにおけるCLDN1および7の局在、発現とほぼ同じ表現型である、細胞膜上の局在ではなく、細胞質に点状の発現パターンを示した。またGDLD患者でこれまでに発見されたミスセンス変異によるGDLD発症のメカ ニズムについても検討した。ミスセンス変異によってTACSTD2は本来局在すべき細胞膜に局在せず、またグリコシレーションについても異常なパターンを示した。
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| 今後の研究の推進方策 |
CLDN7タンパクが凝集することがGDLDの分子病態の根幹である可能性がある。CLDN7タンパクの凝集過程とその分解経路についてさらに検討する こととする。また、ミスセンス変異をもつTACSTD2遺伝子はこれまで発現するものの何らかの理由によって機能喪失していると考えていたが、多くのミスセンス変異においてTACSTD2タンパクが小胞体内部においてフォールディングエラーを生じ、ERADの経路によって分解される可能性があるためこれについても阻害剤の実験などで検討していく。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
細胞の樹立、および強制発現のためのプラスミドの作製が想定よりも遅延した。そのため次年度使用額が生じた。CLDN7タンパクの凝集過程とその分解経路について検討すること、およびミスセンス変異をもつTACSTD2タンパクの分解についてさらに検討を進めることとする。
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