| 研究課題/領域番号 |
18K09476
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| 研究機関 | 東京医科歯科大学 |
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研究代表者 |
森 弘樹 東京医科歯科大学, 大学院医歯学総合研究科, 教授 (80345305)
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| 研究分担者 |
植村 法子 東京医科歯科大学, 医学部附属病院, 助教 (10568017)
田中 顕太郎 東京医科歯科大学, 大学院医歯学総合研究科, 教授 (20569503)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | 神経細胞 / 角化細胞 / 物理刺激 |
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| 研究実績の概要 |
本研究はケラチノサイト・神経細胞の共培養にて物理刺激を加えてTRPチャネルの発現状態と神経成長因子との関連性を探ることを目的とする。培養実験において、ケラチノサイト/神経共培養モデルを作成し、単独培養と比較することを計画している。
本年度は実験計画における備品購入（超低温槽）、抗体購入など、実験環境を整え、「伸展培養もしくは振盪機を用いた物理的刺激による各種因子の検討」を開始した。当初は神経細胞とケラチノサイトの共培養を行い、伸展刺激を加えることを計画していた。神経細胞伸展装置(STB-140 ストレックス)に装着するシリコンチャンバー（ストレックス）に対し、ポリ-D-リシン/ラミニンにてコーティングを行い、神経細胞（ラット脊髄ガングリオン由来細胞）の培養を行った。培養1週間程度で神経細胞の接着、神経突起の伸長が認められたものの、複数のチャンバーにおいてコーティング膜の器材からの剥脱が起こり、細胞の観察が困難となったため、継続を断念した。コーティングの器質には伸展性がなく、伸展するとさらに剥脱がすすむものと予想された。実験中止時に試験的にチャンバーを用手的に伸展したが複数個所で剥脱し、細胞の観察は困難になると予想された。このため今後は振盪器を用いた物理刺激での実験に移行予定である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
細胞としてはラット神経節ガングリオン由来細胞（Rat Dorsal Root Ganglion QBCellScience）を用いて、コーティング剤として、Poly-D-lysine hydrobromide (SIGMA P6407-5MG)および、Laminin (SIGMA L2020-1MG)を選択した。コーティングはPoly-D-lysine hydrobromideが30μg/ml、Lamininが2μg/mlとなるように希釈し、200μl/㎝2の濃度でシリコンチャンバー（ストレックス）に分注した。4℃でオーバーナイト留置し、浮遊液を吸引、滅菌水でリンスしたのち、2時間室温で乾燥した。その直後に4.56×105/mlでラット神経節ガングリオン由来細胞を播種した。培地は前回と同様抗生剤およびinhibitor添加NSF-1を用いた。5日目に神経細胞の接着と神経突起の伸長を認めたが、一定数の浮遊細胞も認めた。また、一部のチャンバーにコーティングの剥脱が認められ、神経細胞の観察が困難となった。14日程度で10個中3個のチャンバーにおいてコーティングの剥脱が認められ、また、コーティングが剥脱していないチャンバーにおいても神経細胞の接着が不良となったため、実験を中止した。
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| 今後の研究の推進方策 |
神経細胞培養において、ストレッチチャンバーのコーティングが困難である可能性は計画段階で検討されていた。ストレッチチャンバーでの伸展培養が確立できないため、振盪機での物理刺激に変更する予定である。ポリ-D-リシン/ラミニンがプレコーティングされた24well dishを用いて、インキュベーター内に振盪機を設置し、物理刺激を加えた共培養を行う。細胞が接着した1日目から振盪を開始する。振盪の条件は180rpmとする（Leite LG, et al. J Nematol. 2016;48:126-33.）。現在、振盪器タイテック社の高湿度対応振とう機セルシェーカーCS-LRを購入予定である。有意差のある結果が得られなかった場合は、培地の組成や伸展開始日もしくは振盪の頻度を15rpm程度に下げるなどの条件を変えて、実験条件の最適化を行う。採取したヒト検体で安定した結果が得られない場合は購入細胞を検討する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
実験がやや遅れており、細胞や抗体の購入が少なかったためである。次年度は振盪器の購入などもあり、支出が増える見込みである。
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