| 研究課題/領域番号 |
18K09488
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| 研究機関 | 京都府立医科大学 |
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研究代表者 |
素輪 善弘 京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 講師 (80468264)
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| 研究分担者 |
松田 修 京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (00271164)
岸田 綱郎 京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 准教授 (00370205)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | シュワン細胞 / ダイレクト・リプログラミング / 末梢神経 / 小分子化合物 / 線維芽細胞 / 坐骨神経 / SOX10 / Krox20 |
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| 研究実績の概要 |
今年度はシュワン細胞のダイレクト・リプログラミングを誘導する小分子化合物として、Krox20の機能を代替する小分子化合物の探索を行った。まずヒト線維芽細胞に、Sox10を単独で遺伝子導入し、小分子化合物Core Libraryの化合物を網羅的手法で添加し、培養後、シュワンマーカーS100bを蛍光染色し、蛍光プレートリーダーで蛍光強度を定量した。S100b発現定量による数値化をスクリーニング系としてKrox20の代替え化合物としてCompound Aを同定した。
線維芽細胞をシュワン細胞誘導培地で培養したところ、約72時間後には、位相差顕微鏡で明るく見える類円形の細胞体と数本の長い突起を有した(双極性形態)SC様の細胞を認め、1週間後には多くの細胞が同様の形態に変化しているのが確認された。
8,14および21日後にRNAを抽出し、SOX10,Krox20,S100b mRNAの相対的発現レベルを経時的にreal time RT-PCRにて定量した結果では、Compound Aおよびシュワン誘導培地を用いない線維芽細胞に比較して、8日目に約3倍、14日目に29倍、21日目に6倍の発現の上昇がみられた。
同様にS100bにおいても8日目に約3倍、14日目に27倍、21日目に16倍の発現の上昇がみられ、シュワン誘導培地を用いたがCompound Aを用いていない細胞に対しても約2.5倍の発現が見られた。しかしながら、これらの発現はdSCの発現と比較すると、はるかに低いものあり、またSOX10の発現は14日目には発現の上昇が確認されたが、その他のTime Pointでは確認されなかった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
線維芽細胞からシュワン細胞への直接転換の計画において本研究の主旨となる導入遺伝子SOX10とKrox２０の代替え化合物の探索において、おおよそKrox20と類似した作用を持つ化合物が同定されたため。
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| 今後の研究の推進方策 |
次に、Sox10の機能を代替する小分子化合物を見出す。今年度とは逆に、ヒト線維芽細胞にKrox20を単独で遺伝子導入し、この細胞を用いて同様のスクリーニングを行う。
今年と同様に、S100b染色強度とS100bとP75NTRのmRNA定量を指標として、最も効率よく高品質なシュワン細胞を誘導できる２つの化合物の組み合わせを決定する。誘導したシュワン細胞（chemically converted Schwann cells＝ccSC）についてGFAP、GAP43、NG2、SOX10の発現を免疫染色、mRNA定量を行う。また網羅的遺伝子発現プロファイルをDNAマイクロアレイ解析で調べ、遺伝子導入により導入したシュワン細胞と比較検討する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
次年度に追加実験に必要な物品を購入する必要性が生じたため。
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