| 研究課題/領域番号 |
18K09506
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| 研究機関 | 九州大学 |
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研究代表者 |
久木田 敏夫 九州大学, 歯学研究院, 教授 (70150464)
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| 研究分担者 |
久木田 明子 佐賀大学, 医学部, 准教授 (30153266)
久本 由香里 九州大学, 歯学研究院, 助教 (40729026)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | 骨改造制御 / 膜表面分子 / 質量分析 / モノクローナル抗体 / 骨芽細胞 / 破骨細胞 |
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| 研究実績の概要 |
骨改造は健康な骨の維持に必須の現象であるが、その調節機構については不明の点が多い。本研究では骨改造制御の中でも破骨細胞分化開始部位の本体に焦点を当てて解析を進めてきた。骨の表面を覆う骨芽細胞系の細胞の膜表面に骨改造制御に関わる新規分子が存在するものと仮定し、免疫学的手法を用いて網羅的に検索した。その結果、骨芽細胞が特異的に発現し破骨細胞形成誘導を制御し骨芽細胞の石灰化を制御する膜表面分子A7抗原を見出した。骨芽細胞の膜表面蛋白質をビオチン標識後、可溶化し、免疫沈降法による膜抗原分子の検出を行いA7抗原分子の検出を行った。更にA7抗原検出と同様の条件を用いて、標識していない骨芽細胞の細胞膜を可溶化後、磁気ビーズを用いて免疫沈降後、徹底的にビーズを洗浄した後、TFA（Tri-fluoro acetic acid)を用いて抗原分子の溶出を行った。溶出液を凍結乾燥後、質量分析用SDSサンプルバッファーに溶かし、SDS PAGEで分離後、銀染色を施した。該当する蛋白質バンドを切出し、ゲル内トリプシン消化後、得られたペプチドについてLC-MASSによる質量分析を行った。Mascot解析等の結果、候補分子が複数見出されたので、骨芽細胞における各候補分子の遺伝子発現についてrtPCR法を用いて解析し、遺伝子発現を確認した。その結果、細胞外環境の検出に関与する膜表面分子Xを見出したので、分子Xについて重点的に検討することとした。分子Xの石灰化制御における関与と役割を検討する為に、種々の細胞外環境下における分子Xの発現変動について遺伝子発現及び蛋白質発現を解析している。また、分子Xを特異的モノクローナル抗体でブロックした場合の細胞外環境への応答と石灰化への影響を解析している。破骨細胞分化との関連についても検討中である。本研究により骨改造制御の新局面が明らかになるものと思われる。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
Mascot解析等の結果、候補分子が複数見出されたので、骨芽細胞における各候補分子の遺伝子発現についてrtPCR法を用いて解析し、遺伝子発現を確認した。その結果、細胞外環境の検出に関与する膜表面分子Xを見出したので、分子Xについて重点的に検討することとした。分子Xの石灰化制御における関与と役割量分析に十分な免疫沈降画分を得る実験条件（膜表面分子抽出、免疫沈降、洗浄及び抽出等の条件）の設定を試行錯誤したため、設定に長期の時間を要したため、本研究計画がやや遅れている。
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| 今後の研究の推進方策 |
分子Xの石灰化制御における関与と役割を検討する為に、種々の細胞外環境下における分子Xの発現変動について遺伝子発現及び蛋白質発現を解析する。また、分子Xを特異的モノクローナル抗体でブロックした場合の細胞外環境への応答と石灰化への影響を解析する。破骨細胞分化との関連についても検討中である。本研究により骨改造制御の新局面が明らかになるものと思われる。基本的には頭初の研究計画に準じて、分子Xの骨改造制御機能について重点的に解析し、可能な限りインパクトの高い欧米の学術誌に受理されるように、質の良い実験データを積み重ねていく。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
質量分析による解析が遅れた為、候補分子の同定までは実施できたが、機能解析実験を実施することができなかった。そこで、抗原分子の機能解析実験と動物実験に要する費用を次年度（最終年度）使用額として残すこととした。抗原分子の候補分子を絞り込んむことができたので、最終年度はほぼ、研究計画通りに本研究を進めることができるものと思われる。
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