| 研究課題/領域番号 |
18K09518
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| 研究機関 | 大阪大学 |
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研究代表者 |
高畑 佳史 大阪大学, 歯学研究科, 助教 (60635845)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | RNA seq / 軟骨分化 / リン酸化シグナル / CRISPR/Cas9 |
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| 研究実績の概要 |
細胞内シグナル伝達機構におけるリン酸化カスケードは、サイトカイン刺激などによって各種プロテインキナーゼが活性化し、下流に情報を伝える有力なシステムである。なかでも骨形成因子BMPがSmad分子のリン酸化を誘導し、強い骨・軟骨形成を促進することは周知の事実である。本研究では、効率的な骨・軟骨分化を導入するための分化を決定する特異的シグナルを分子レベル、さらには個体レベルで理解することを目指し、リン酸化シグナルで重要なプロテインキナーゼの同定と機能解析を行った。まず多分化能を有する肢芽細胞に対してBmp2を作用させ、RNA seqを用いてコントロール群と比較して上昇したプロテインキナーゼを検索した。その結果、発現上昇が顕著でかつ機能が未知の遺伝子に着目し、新規のセリンスレオニンプロテインキナーゼ32a (Stk32a)およびセリンスレオニンプロテインキナーゼ32b(Stk32b)に絞り込みをかけ、これらの遺伝子の機能について個体レベルでの解析を行った。
CRISPR/Cas9法によりそれぞれの遺伝子ノックアウト(KO)マウスを作成した。このマウスの表現系を解析すると、Stk32aとStk32bのいずれのKOマウスも繁殖が可能であり、野生型マウスと比べて成長に著しい差異を認めなかった。さらにこれらのKOマウスの胎生期の骨表現系を解析した結果、Stk32aKOマウスでは胎生１４日目の上腕骨に軽微な伸長の阻害が認められた。しかし、これらの遺伝子KOマウスの骨表現系の変化は軽微であり、軟骨分化に重要な役割を担っているかどうかさらなる検討を行う必要がある。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
1: 当初の計画以上に進展している
理由
本研究計画では、未分化間葉系細胞から軟骨分化に重要な因子を同定し、同定したプロテインキナーゼの細胞レベルでの解析を通じて機能的役割を明らかにすることである。初年度において新規プロテインキナーゼが細胞レベルで軟骨細胞の石灰可能を制御することや、骨形成に必須の転写因子Runx2, Osterixの発現制御に関わっていることを明らかにした。引き続き、本年度はCRISPR/Cas9によるゲノム編集により同定したプロテインキナーゼのマウス個体における解析を進めるため、同定した遺伝子のノックアウトマウスを作成した。作成した遺伝子改変マウスの表現系および骨表現系の解析を行い、胎生14日目の上腕骨が野生型マウスと比較して成長の遅延が認められた。従って、軟骨分化に重要なプロテインキナーゼ遺伝子の同定と、遺伝子の個体レベルでの機能解析が進展認め、当初予定していた研究計画以上に順調に進展していると考えられる。
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| 今後の研究の推進方策 |
本年度の研究実績では、新規プロテインキナーゼのin vivoモデルにおける個体解析を行うために、遺伝子ノックアウトマウスを作成し、その骨表現形を解析した。しかしながら、新規プロテインキナーゼのノックアウトマウスの骨表現形は野生型と比較して非常に軽微な変化であった。本研究で同定した新規プロテインキナーゼは同じファミリー遺伝子であり、機能的に代償している可能性がある。そのため、新規プロテインキナーゼを一つ遺伝子ノックアウトしただけでは解析が不十分であることが考えられるため、同定したStk32aおよびStk32bのダブルノックアウトマウス作成を行い、骨表現形の解析を今後行う必要がある。さらにStk32aおよびStk32bのダブルノックアウト細胞から標的リン酸化タンパク質を質量分析を用いて同定し、骨軟骨分化に与えるリン酸化タンパク質の重要性について更なる検討を重ねる予定である。
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