| 研究課題/領域番号 |
18K09530
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| 研究機関 | 日本歯科大学 |
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研究代表者 |
田谷 雄二 日本歯科大学, 生命歯学部, 准教授 (30197587)
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| 研究分担者 |
添野 雄一 日本歯科大学, 生命歯学部, 教授 (70350139)
白子 要一 日本歯科大学, 生命歯学部, 助教 (50756377) [辞退]
堀江 哲郎 日本歯科大学, 生命歯学部, 講師 (10508675)
佐藤 かおり 日本歯科大学, 生命歯学部, 講師 (90287772)
佐々木 康成 地方独立行政法人神奈川県立病院機構神奈川県立こども医療センター(臨床研究所), 臨床研究所, 部長 (70332848)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | 歯学 / 病理学 / マウス胎仔 / 顎顔面発生 / 舌下神経 / 舌筋発生 / ガイダンス因子 |
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| 研究実績の概要 |
本研究の目的は、舌運動を担う舌下神経の発生に焦点を絞り、後頭神経核から遠隔の舌原基までの軸索伸長を誘導する分子制御の仕組みを明らかにすることである。舌下神経は舌運動を支配する舌組織唯一の運動神経である。舌運動支配のために舌下神経と舌筋が連結するには、舌下神経軸索が舌組織の正確な部位まで伸長していることが前提となる。今までの私たちの研究から、マウス舌初期発生では、後頭神経核から起始した舌下神経軸索は、先行する舌筋前駆細胞の移住経路を辿って伸長し舌原基にまで到達することが想定された。
この仮説を実証するために、本年度では、昨年度から実施している後頭領域から舌原基までの舌筋前駆細胞の移住と舌下神経軸索の伸長の過程を継続して解析した。この解析では、主に胎生9.5～12.5日のICRマウスの連続切片を筋系譜（Desmin）と神経軸索（Gap43）の特異抗体で二重標識し追跡した。神経軸索と筋前駆細胞を標識した３次元観察では、後頭神経核から起始した舌下神経軸索は後頭体節近傍の体幹間充織内で先行して遊走する舌筋前駆細胞の集団と合流後、細胞集団のなかを互いに接触しながら伸長し、下顎突起正中部の外側舌隆起直下に到達する過程を詳細に観察した。DNAマイクロアレイ分析を遂行し、Ingenuity Pathway Analysis（IPA）解析により発現遺伝子のGO分類と、舌筋前駆細胞の移住および舌下神経軸索の伸長に関わる遺伝子の発現を探索した。マイクロアレイ解析データから抽出された有力な候補遺伝子についてはリアルタイムPCRにより発現量の変化を検証した。舌下神経軸索の伸長に特異的な遺伝子発現（mRNA）を制御するmicroRNA（miRNA）の解析を検討するために、miRNAマイクロアレイの実施に向けた準備を開始した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
2019年度では、昨年から開始した自動回転式ミクロトームとSTSシステム(Section Transfer System)を用いた胎生9.5～12.5日のICRマウス頭頸部の連続切片の作製技術が向上し、コンスタントに作成することができるようになった。また、舌下神経軸索と舌筋前駆細胞との組織空間での位置関係を明らかにするために必須である筋系譜（Desmin）と神経軸索（Gap43）の特異抗体で二重標識する免疫組織化学では、昨年度に条件を設定したものの染色ムラなどの問題が残っていた。これに関して試薬のアプライする方法の改善に取り組み、毎回的確に染色できるように克服できたと考えている。その結果、免疫組織化学により染色した組織切片はバーチャルスライドシステム（NanoZoomer HT; Hamamatsu Photonics, Hamamatsu, Japan)とImageJ plug-inソフト（3D configurationと3D representation）を併用して、画像中の筋系譜（Desmin；赤）と神経軸索（Gap43；青）を色抽出して分別することや、連続組織切片から伸長する舌下神経軸索と遊走する舌筋前駆細胞集団の組織立体構築を行うことが容易となった。
さらに、本申請課題に特化したDNAマイクロアレイ分析から、発現遺伝子のGO分類と、舌筋前駆細胞の移住および舌下神経軸索の伸長に関わる遺伝子を探索し、その整理方法や分析の的確なやり方を試行しながら進めている。
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| 今後の研究の推進方策 |
最終年度では、DNAマイクロアレイ分析とIngenuity Pathway Analysis（IPA）による発現遺伝子のGO分類と、舌筋前駆細胞の移住および舌下神経軸索の伸長に関わる遺伝子発現のデータの解析から得られた有力な候補遺伝子について、その検証と実証に向けた解析を実施する。この解析では、顕微切断法とリアルタイムPCRの併用による発現量変化の検証を実施するとともに、遺伝子発現の阻害実験の実施も視野に入れる。また、microRNA（miRNA）は様々な遺伝子発現の制御を行っていることが知られている。そこで、舌下神経軸索の伸長に特異的な遺伝子発現（mRNA）を制御するmicroRNA（miRNA）の解析を検討するために、microRNAマイクロアレイを実施し、網羅的にmicroRNAの発現を把握する。さらに、顕微切断法とリアルタイムPCRの併用によるmicroRNAの発現量変化の検証を行い、舌下神経軸索の伸長を制御するmicroRNAを突き止める。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
2019年度では、研究分担者の作業配分を効率化したことと研究の進展状況から実験補助を依頼する予定であった大学院生への謝金が予定額よりも抑えられたため、次年度使用額が生じた。今後の研究の推進方策として、計画していたmicroRNA発現の解析で、microRNAマイクロアレイ解析で注目された遺伝子候補を増やして、これらの遺伝子候補について リアルタイムPCRによる検証と発現パターン解析のために必要な核酸抽出試薬やリアルタイムPCR用の試薬とプライマーに使用する。
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