| 研究課題/領域番号 |
18K09535
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| 研究機関 | 徳島大学 |
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研究代表者 |
村上 圭史 徳島大学, 大学院医歯薬学研究部(歯学域), 准教授 (10335804)
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| 研究分担者 |
天羽 崇 徳島大学, 大学院医歯薬学研究部(歯学域), 特任助教 (00803545) [辞退]
藤猪 英樹 徳島大学, 大学院医歯薬学研究部(歯学域), 教授 (50356250)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | 緑膿菌 / ２成分制御系 / バイオフィルム / 抗菌薬抵抗性 |
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| 研究実績の概要 |
慢性感染症の原因として、バイオフィルム感染症が問題となることが多いものの、抗菌薬が十分な殺菌効果が得られない理由として、バイオフィルムそのものの物理的なバリヤー効果よりも、抗菌薬抵抗性が重要であることが認識されつつある。しかしながら、そのメカニズムについてはまだ不明な点が多い。我々はこれまでに，バイオフィルムのモデル細菌である緑膿菌について，抗菌薬抵抗性に関与する因子として，RNAポリメラーゼσ因子，セカンドメッセンジャーであるc-di-GMP，菌体外多糖合成に関わるpsl遺伝子，２成分制御系などが重要な役割を担っていることを報告してきた。本研究では，cbrA-B, phoB-Rを中心とした２成分制御系に着目し，シグナル伝達経路を明らかにすることにより，抗菌薬抵抗性メカニズムを解明し，慢性難治性感染症であるバイオフィルム感染症に対する，新たな治療薬のターゲットを見出すことを目標としている。
1) 抗CbrB, 抗PhoBポリクロナール抗体の作製
His-Tag融合タンパク質CbrBの大腸菌での大量発現に成功し，精製を実施中であるが、精製効率が悪いため、精製方法の最適化を検討中である。
2)抗菌薬抵抗性に関与する２成分制御系遺伝子の検討
緑膿菌は、染色体上に６４個のセンサーと７２個のレギュレーターを保有しているものの、個々の役割は不明なものが大半である。そこで、cbrA-B, phoB-R以外の抗菌薬抵抗性に関与する新たな２成分制御系を見出すため、現在６個の欠損変異株を作成し、バイオフィルム形成菌での抗菌薬抵抗性を検討中である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
抗CbrBポリクロナール抗体の作製について、His-Tagベクターへクローニングに成功し，大腸菌での発現誘導には成功しているもの、精製効率が悪いため、十分な収量が得られていない。現在精製方法について、プロトコールの最適化を検討している。また抗PhoBポリクロナール抗体作成のための、PhoBタンパク質の精製については、発現誘導に成功していないため、現在至適条件を検討中である。
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| 今後の研究の推進方策 |
CbrBタンパク質の精製を完了し，抗CbrB抗体の作製を実施する。抗Cbr抗体が作製出来れば，Chip-seq解析を実施し，制御遺伝子を探索する。また，cbrA-B, phoB-R遺伝子以外の２成分制御系にも着目しており、６個の欠損変異株について、バイオフィルム形成菌での抗菌薬抵抗性への関与について、詳細に検討していく予定である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
タンパク質の精製が完了出来なかったことにより、抗体作成が実施できなかったため。
次年度は、タンパク質精製を完了予定であり、抗体作成や制御遺伝子を網羅的に検討すためのChip-seq解析を予定しており、次年度請求額とあわせ、必要な試薬を購入する予定である。
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