| 研究課題/領域番号 |
18K09536
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| 研究機関 | 長崎大学 |
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研究代表者 |
門脇 知子 (筑波知子) 長崎大学, 医歯薬学総合研究科(歯学系), 准教授 (70336080)
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| 研究分担者 |
筑波 隆幸 長崎大学, 医歯薬学総合研究科(歯学系), 教授 (30264055)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | 炎症応答 / マスト細胞 / Rabタンパク質 |
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| 研究実績の概要 |
Rabタンパクは細胞内小胞輸送の重要な制御因子であり、Rabタンパクの機能異常は様々な神経疾患や免疫疾患を引き起こすことが知られている。我々は独自の研究から、破骨細胞の分化過程で一過性に発現上昇する新規Rab因子であるRab44を発見した。Rab44は、他のRabアイソフォームにはみられない特徴的なモチーフをもつタンパク質であるが、その機能はわかっていない。我々は、Rab44が、マスト細胞に高発現していることを見出した。マスト細胞は、アレルギー反応において中心的な機能を担う細胞で、強力な炎症性メディエータ―を放出する。破骨細胞もまた、マスト細胞と同様に炎症性メディエータ―を細胞外に分泌し、その分泌機構は複雑に制御されている。我々はRab44がこれらの細胞の細胞外分泌の制御に関わると考え、Rab44のマスト細胞における機能を解析し、炎症性免疫応答におけるRab44の寄与を解明することを目的とした。
まずin vitro アプローチとして培養細胞を用いたRab44過剰発現系を作製し、細胞機能の変化とRab44の局在を調べた。ヒト子宮頸がん細胞株であるHeLa細胞にGFP融合Rab44を発現させるとリソソームのマーカーであるLamp1と大部分が共局在を示した。マウス骨髄由来マスト細胞の細胞染色においても、内在性のRab44がLamp1やカテプシンDと共局在することからもRab44はリソソームに局在することが示唆された。また、ラット好塩基球性白血病細胞であるRBL細胞にRab44を過剰発現させると抗原刺激により脱顆粒が亢進することから、Rab44は炎症性メディエーターの分泌を制御していることが示唆された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
Rab44の培養細胞における発現系の構築、CRISPR/Cas9システムによるノックアウトマウスの作製がほぼ完了し、in vitroおよびin vivoでの解析システムの構築が計画に沿って予定通り進行している。また、Rab44の各機能ドメインの変異体も数種類作製済みで、順次、細胞内局在と機能を解析しているところである。
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| 今後の研究の推進方策 |
マスト細胞(プライマリーおよび細胞株)においてsiRNAによりRab44遺伝子をノックダウンし、IgEと抗原で刺激した時のヒスタミンならびにリソソーム酵素の分泌量の変化を調べているところであり、再現性を確認する。また、分泌される物質についてもヒスタミンやリソソーム酵素だけでなくロイコトルエンやサイトカインなど複数、解析する。また、リコンビナントRab44について、野生型だけでなく、各ドメイン欠失変異体や恒常的活性型、不活性型変異体を培養細胞に過剰発現させて機能的変化を調べる。さらにRab44と相互作用する分子をプルダウンアッセイや免疫共沈で捕捉しMS解析で同定する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
小型超低温フリーザーの老朽化により新規購入を予定していたが、消耗品として抗体やELISAなどの高額試薬が必要であるため、研究分担者の研究室にてサンプルの長期保存をしてもらうことで、フリーザー購入予定相当額を来年度の試薬購入に充てられるよう努力をした。
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