| 研究課題/領域番号 |
18K09536
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| 研究機関 | 長崎大学 |
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研究代表者 |
門脇 知子 (筑波知子) 長崎大学, 医歯薬学総合研究科(歯学系), 准教授 (70336080)
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| 研究分担者 |
筑波 隆幸 長崎大学, 医歯薬学総合研究科(歯学系), 教授 (30264055)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | アレルギー反応 / アナフィラキシー / Rabタンパク質 / 免疫応答 |
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| 研究実績の概要 |
Rabタンパク質は小胞輸送の制御分子である。昨年度までにRab44がマスト細胞の脱顆粒を制御することを示唆する結果を得ていた。そこでsiRNAによりマウス骨髄由来マスト細胞におけるRab44の発現を抑制すると、IgE依存性のリソソーム脱顆粒およびヒスタミン分泌が有意に低下した。さらにCRISPR/Cas9システムによりRab44を完全欠損する変異型マウスを作製した。Rab44-/-マウスはメンデルの法則に従って生まれ、生育状態や外見上はRab44+/+マウスとほとんど差がなかった。しかしながら、DNP-HSAを抗原とするアナフィラキシー誘導において、明らかに野生型より反応が減弱していた。この時、血中のヒスタミン濃度は有意に低下していた。また。卵白アルブミンで刺激した場合もアナフィラキシー反応は減弱した。このようにin vivoにおいてもRab44がアレルギー反応に関わっており、免疫細胞からリソソーム酵素や炎症性メディエータ―を細胞外に分泌する際の調節を行っていることが示された。
さらにRab44のマウスにおける全身臓器・組織分布の詳細を解析した。Rab44は主に骨髄に発現が見られ、精巣上体、肺、脾臓、皮膚、卵巣にも幾分か発現することがわかった。共焦点レーザー顕微鏡による免疫染色によって、Rab44は骨髄細胞の中でもCD117+細胞に局在を示し、Sca-1/Ly6a+細胞には局在しなかった。骨髄細胞からマクロファージ、好中球、樹状細胞に分化させるとRab44の発現は下がり、ヒト単球性白血病細胞THP-1においてもマクロファージ様細胞に分化させるとRab44のmRNAは減少した。このようにRab44の発現は細胞の分化や機能に密接に関連していることが示唆された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
CRISPR/Cas9システムによるノックアウトマウスの作製が完了し、その解析が着実に進んでいる。一つの表現型としてRab44の欠損マウスではアレルギー反応が低下することを見出した。また、野生型マウスの全身、臓器、組織、細胞レベルでのRab44の発現も解析し、個体におけるRab44分子の分布が明らかになりつつある。一方、培養細胞における発現系も構築しているので、様々な変異体を発現し、分子レベルでの解析も進行中である。
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| 今後の研究の推進方策 |
ノックアウトマウスの解析を進め、アレルギー応答以外にも変化が表れる事象について解析する。
また、培養細胞系や大腸菌でのリコンビナントタンパク質作製により、Rab44の各ドメインの役割を明らかにし、それぞれのドメインに相互作用する分子を同定する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
小型超低温フリーザーの老朽化により新規購入を予定していたが、消耗品として抗体やELISA、リアルタイムPCRなどの高額試薬が必要であるため、研究分担者の研究室にてサンプルの保存をしてもらうことで、フリーザー購入予定相当額を次年度の試薬購入に充てられるよう努力をした。
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