| 研究課題/領域番号 |
18K09582
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| 研究機関 | 日本大学 |
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研究代表者 |
中山 洋平 日本大学, 松戸歯学部, 准教授 (30434088)
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| 研究分担者 |
小方 頼昌 日本大学, 松戸歯学部, 教授 (90204065)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | 歯肉接合上皮 / アメロチン / 歯周組織 / 細胞間相互作用 / 液性因子 / 歯肉増殖症 |
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| 研究実績の概要 |
さまざまな生体の反応を想定し，歯肉接合上皮におけるアメロチン（AMTN）遺伝子の発現が変化することを明らかにし，そのメカニズムを解明するため研究を継続している。
近年では， TGFβ1に関連した病態を念頭に，アポトーシスおよび上皮間葉移行におけるAMTN遺伝子発現調節機構を明らかにしてきた。薬物性歯肉増殖症にはこのような病態が関与することが報告されていることから，ニフェジピンによる歯肉増殖症における接合上皮特異的遺伝子（AMTNを含む）の発現変化を検索した。その結果，FDC-SP遺伝子の発現が歯肉増殖症歯肉上皮組織中に拡散し，その遺伝子発現レベルも増加することを明らかにした。しかし，他の歯周組織細胞との関連は不明である。
次に，歯周組織構成細胞の相互作用によるAMTN遺伝子発現の変化を検索するために，ヒトの歯肉上皮細胞（TIGKs hTERT），セメント芽細胞（HCEM hTERT）および歯根膜細胞（HPL hTERT）を使用して，各細胞から放出される液性因子の同定を試みている。この実験にはNICO1細胞培養キットを使用した。3種の細胞の組合せ①TIGKs hTERT - TIGKs hTERT（コントロール），②TIGKs hTERT - HCEM hTERTおよび③TIGKs hTERT - HPL hTERTによる共培養を行った。共培養後に細胞を回収した後，ISOGENでRNAを抽出してcDNAを合成し，Real-time PCRに使用した。その結果，TIGKs hTERT中のAMTN遺伝子発現は，HCEMおよびHPLを共培養すると，有意に減少した。このことから，HCEMおよびHPLから放出される液性因子が，AMTN遺伝子発現を抑制することが示唆された。
これらの液性因子を同定するために，共培養に使用した培地成分を網羅的に解析するために，液体クロマトグラフィー解析（LC-MS解析）を行った。その結果，化学構造式から予想される化合物リストをTableにまとめた。各細胞の組合せおける培地成分において，2～10種類の化合物に有意差を認めた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
研究自体はおおむね順調であるが，歯肉上皮培養に費用がかかることなどが，進捗がやや遅い要因の1つである。また，LC-MS分析に時間がかかってしまったことも要因の1つである。
化合物の最終的な同定に至っていないことも影響しているが，予想外に有意差を認めた化合物が多数存在し，最終的な同定には，プロテオーム解析が必須であり，さらに分析に費用がかかるため，今年度へ次のステップを持ち越すことになった。
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| 今後の研究の推進方策 |
Real-time PCRで得られた結果と，タンパクレベルの変化が一致しているかを検索するために，上皮細胞の免疫染色を行う。次に，液性因子の分子量の大きさの違いによって，細胞間相互作用に関わるものを分子量別にスクリーニングするため，NICO1システムの結合部位に，2種類のフィルターを使用してRNAを抽出してReal-time PCRにて比較する。
また，共培養後の培地成分をプロテオーム解析し，LC-MS解析の結果と合わせて，液性因子を同定する。候補の因子を，使用している歯肉上皮細胞に作用させ，類似した結果が得られるかどうか確認する予定である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
歯肉上皮細胞（TIGKs hTERT）の培養に使用する培地および成長因子のキットの購入を，細胞の増殖程度によって決めていた。結果的に，今回は追加購入することがなかったので残金として次年度使用額が生じた。残金は，培養キットおよび培地の追加購入時に使用する予定である。
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