| 研究課題/領域番号 |
18K09583
|
|---|
| 研究機関 | 日本大学 |
|---|
研究代表者 |
高井 英樹 日本大学, 松戸歯学部, 講師 (30453898)
|
|---|
| 研究分担者 |
小方 頼昌 日本大学, 松戸歯学部, 教授 (90204065)
|
|---|
| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
|
| キーワード | 分化誘導 / miRNA / 歯根膜線維芽細胞 |
|---|
| 研究実績の概要 |
歯周治療中に抜歯となった歯の歯根膜を採取し、ヒト歯根膜線維芽細胞（HPDL)を 抽出し、10%ウシ胎児血清（FBS）および１％ペニシリン－ストレプトマイシンを含むDMEMを用いて継代３～６までHPDLを培養した。また、歯周組織構成細胞（特に歯肉線維芽細胞（HGF）および歯根膜線維芽細胞（HPDL)）で骨芽細胞より優位に発現しているTwist２およびKlf12の３'-UTRに結合するmiRNAを公開データベースのTargetScanにて検索し、両遺伝子の３'-UTRに結合するmirRNAはmir141および200aであることを確認した。次に、mi141および200aが結合するTwist２の３'-UTR をPGL3 promoterルシフェラーゼプラスミドに挿入し、シークエンス解析を行い、正しい配列が挿入されたか確認した。正しい配列が挿入されたルシフェラーゼプラスミドを挿入したHPDLはmi141または200aを細胞内に４時間導入後、10%FBSを含むDMEMで68時間細胞培養し回収後にルシフェラーゼ活性を計測すると活性は抑制された。さらに、HPDLを様々な大きさのディッシュに播種し、mir141または200aを細胞内に4時間導入後、10%FBSを含むDMEMで68時間細胞培養したHPDLを回収し、全RNAおよびタンパク質を抽出し、間葉系細胞に発現する転写因子RNAおよびタンパク質量をReal-time PCRおよびWestern Blotにて検索を行った結果、Twist2およびKlf12mRNAおよびタンパク質量を減少させ、Sox5およびTrips1mRNAおよびタンパク質を増加させた。
|
| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
歯肉歯根膜細胞の継代培養に成功し、研究を完了するのに十分な細胞を確保できた。また、Twist2およびKlf12に結合するmirを検索し、mir141と200aであることを確認でき、Twist2 3'UTRを含んだルシフェラーゼプラスミドを作製に成功し、ルシフェラーゼアッセイを行い、ルシフェラーゼ活性の抑制を認めた。mir141または200aを細胞内に4時間導入後、10%FBSを含むDMEMで68時間細胞培養したHPDLから抽出した全RNAおよびタンパク質を用いて間葉系細胞に発現する転写因子の発現について検索し、Twist2およびKlf12の発現量の抑制およびTrps1とSox5の発現量の増加を確認できた。
|
| 今後の研究の推進方策 |
mi141および200aが結合するKlf12の3'-UTRをPGL3 promoterプラスミドに挿入し、シークエンス解析を行い、正しい配列が挿入されたか確認し、作成したルシフェラーゼプラスミドを用いてルシフェラーゼ活性を計測し、miRNAが予想される配列に結合するか検索する。また、mir141または200aを細胞内に4時間導入後、10%FBSを含むDMEMで68時間細胞培養したHPDLから抽出した全RNAおよびタンパク質を用いて間葉系細胞に発現する転写因子および分化マーカー遺伝子の発現について検索する。さらに、miRNAを導入し培養した HPDLをさまざまな細胞染色法（アリ ザリンレッド染色、アリシアンブル ー染色、オイルレッドO染色）で染色し、細胞の分化を検討する。
|
| 次年度使用額が生じた理由 |
今年度は今後の研究に必要なプラスミド作製を行わなかったため、試薬購入のための研究費に余りが生じた。次年度はこの研究費も使用して試薬を購入する。
|
