| 研究課題/領域番号 |
18K09593
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| 研究機関 | 千葉大学 |
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研究代表者 |
土田 祥央 千葉大学, 医学部附属病院, 特任助教 (90410422)
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| 研究分担者 |
佐藤 守 千葉大学, 医学部附属病院, 特任准教授 (20401002)
西村 基 千葉大学, 医学部附属病院, 講師 (80400969)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | GCF / HGFs / プロテオミクス / 質量分析計 / ユビキチン化 |
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| 研究実績の概要 |
近年の技術革新により、タンパク質のユビキチン化を網羅的に探索することも可能になりつつあるが、歯周疾患の解明に応用するための方法論は確立されていない。本研究はユビキトーム解析を発展させ、様々な疾患に起こりうる代表的な翻訳後修飾であるユビキチン化に焦点をあてて、歯周疾患におけるユビキチン化を網羅的探索により捉え、歯周疾患の早期診断および再発予測治療効果判定等に応用することを目的としている。
本年度ではキャリアプロテインの影響を受けずに高効率で再現性が良い有機溶媒沈殿法を用いて歯肉溝浸出液(GCF) とヒト歯肉線維芽細胞(HGFs)からペプチドの抽出を試みた。抗ユビキチン抗体をカップリングしたカラムにGCFタンパク抽出液ならびにHGFs細胞抽出液を添加し、抗ユビキチン抗体を用いた免疫沈降を行って、ユビキチン化タンパク質を濃縮した。精製したユビキチン化タンパク質をトリプシン消化後、質量分析装置を用いたショットガン解析を行った。ユビキチン化されたリシン残基を含むトリプシン消化ペプチドピークを検出した。ポリユビキチン化タンパク質のトリプシン消化で生じるユビキチン由来のLys-Gly-Glyを含むシグネチャーペプチドの配列はポリユビキチン鎖の結合型ごとに特有であることが予想される。従って、現在、各結合型に特有なシグネチャーペプチドの検出とMS/MS解析による結合型の特定とショットガン解析で特定の標的タンパク質に結合したポリユビキチン鎖の種類の同定を行っている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
本研究課題の進捗状況はやや遅れいると思われる。その理由は有機溶媒沈殿法を用いたヒト歯肉線維芽細胞(HGFs)からペプチドの抽出に 労力がかかってしまったためである。GCFのペプチド抽出はすでに確立されいたため問題なくペプチド抽出は可能であった。また抗ユビキチン抗体を用いた免疫沈降によるユビキチン化タンパク質の濃縮についても若干遅れたが、想定内の遅れであった。
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| 今後の研究の推進方策 |
今後の研究の推進方策であるが、まずはショットガン解析で特定の標的タンパク質に結合したポリユビキチン鎖種類の同定を予定している。次にSILAC（stable isotope labeling by amino acids in cell culture）法によってユビキチンリガーゼの基質探索を試みる。SILAC法は細胞培養液中の必須アミノ酸を安定同位体標識したものに置き換えたサンプルを調整し、混合して質量分析計で測定する手法である。非標識と標識を質量分析計で区別できるため、ペプチドの同定と同時に複数サンプルの比較定量が可能である。健常群と疾患群を混合して結合タンパク質を用いた免疫沈降とSILAC法にて同定と同時に定量を行う。ユビキチンリガーゼアダプタータンパク質の調節器として作用するF-Box タンパク質を 中心に網羅的な基質探索を行う予定である。その他の検討についは当初の研究計画にそって進めていく。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
購入予定であった試薬が国内に在庫が無く、海外取り寄せで年度内での納品ができなかったため、5365円を繰り越している。 次年度以降は当初の研究計画にそって使用していく。
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