| 研究課題/領域番号 |
18K09593
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| 研究機関 | 日本大学 |
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研究代表者 |
土田 祥央 日本大学, 医学部, 助手 (90410422)
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| 研究分担者 |
佐藤 守 千葉大学, 医学部附属病院, 特任准教授 (20401002) [辞退]
西村 基 千葉大学, 医学部附属病院, 講師 (80400969)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2024-03-31
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| キーワード | 歯周疾患 / ユビキトーム解析 / プロテオミクス / ユビキチン化 / 質量分析計 |
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| 研究実績の概要 |
近年の技術革新により、タンパク質のユビキチン化を網羅的に探索することも可能になりつつあるが、歯周疾患の解明に応用するための方法論は確立されていな
い。本研究はユビキトーム解析を発展させ、様々な疾患に起こりうる代表的な翻訳後修飾であるユビキチン化に焦点をあてて、歯周疾患におけるユビキチン化を網羅的探索により捉え、歯周疾患の早期診断および再発予測治療効果判定等に応用することを目的としている。
本研究は歯肉溝浸出液(GCF)ならびにヒト歯肉線維芽細胞（HGFs）中のユビキチン化タンパク質・ペプチドを探索し、同定後、ポリユビキチン鎖の種類も同定する。見出されたマーカー候補について、質量分析計により直接定量可能なアッセイ系を確立する。また、歯周疾患で高発現しているユビキチン化タンパク質についてもユビキチン化部位を含むペプチドを合成してペプチドアレイを作製する計画である。
高効率で再現性が良い有機溶媒沈殿法を用いてGCFとHGFsからペプチドの抽出を試み、抗ユビキチン抗体をカップリングしたカラムにGCFタンパク抽出液ならびにHGFs細胞抽出液を添加し、抗ユビキチン抗体を用いた免疫沈降を行って、ユビキチン化タンパク質を濃縮した。精製したユビキチン化タンパク質をトリプシン消化後、質量分析装置を用いたショットガン解析を行った。各結合型に特有なシグネチャーペプチドの検出とMS/MS解析による結合型の特定とショットガン解析で特定の標的タンパク質に結合したポリユビキチン鎖の種類の同定を行った。HGFsを用いて結合タンパク質を用いた免疫沈降し、SILAC法(Stable isotope labeling by amino acids in cell culture)にて同定と同時に定量後、疾患で上昇傾向が示唆されたユビキチン化ペプチドを合成してアレイ作製を検討中である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
4: 遅れている
理由
ユビキチン化ペプチドアレイを作製予定であったが、試薬と処理キットがコロナ禍により国内に在庫が無く、海外取り寄せで年度内での納品ができなかったため、進捗状況は遅れている。次年度も当初の研究計画にそって進めていく。
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| 今後の研究の推進方策 |
細かい軌道修正をしながら研究を実行する予定である。歯周病学、質量分析、臨床検査医学の専門家の協力を得て、多面的に研究を遂行する体制を整えることができたと考えている。設備、技術、学術、いずれの面においても十分な研究環境にあるが、臨床応用に耐えうる正確で安定した測定系を構築するためには検証を繰り返す必要がある。次年度では疾患で上昇傾向が示唆されたユビキチン化ペプチドを合成してアレイを作製し、安定させ、有用性を検証し、実臨床の応用を目指す。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
本計画を遂行するためには多くの消耗品が必要であった。しかし、購入予定であった試薬と処理キットがコロナ禍により国内に在庫が無く、海外取り寄せで年度内での納品ができなかったため、繰り越している。次年度はアレイ作製のために使用する。
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