無血清培養系における口腔癌患者由来活性化リンパ球からのiPS細胞の樹立と治療応用

2019 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 18K09723
• 研究機関: 広島大学
• 研究代表者: 山崎 佐知子 広島大学, 病院(歯), 病院助教 (00632001)
• 研究分担者: 岡本 哲治 広島大学, 医系科学研究科(歯), 教授 (00169153) ; 濱田 充子 広島大学, 病院(歯), 歯科診療医 (30760318)
• 研究期間 (年度): 2019-03-01 – 2022-03-31
• キーワード: 口腔癌 / 細胞培養 / 組織再生

研究実績の概要

本研究では口腔癌患者由来細胞から無血清培地を用いてフィーダー細胞を使用せずiPS細胞を樹立・維持し、完全無血清培養系での癌細胞に対する細胞障害活性の高い活性化リンパ球誘導・増殖させ、口腔癌治療の免疫細胞治療への応用を目指すことを目的とし、以下のとおり実施した。
1.インテグレーションフリー・無フィーダー・無血清培養条件での末梢血単核細胞（PBMC）由来hiPS細胞の誘導法効率化：口腔癌患者から採取した末梢血単核細胞（PBMC）を、無血清培地RD6FにIL-2を添加した培地にて初代培養を行い、増殖した活性化リンパ球にセンダイウイルスベクターSeVdpを用いて初期化4遺伝子を導入し、本研究室で開発したhESF9培地を用いてlaminin-E8上に播種しPBMC由来hiPS細胞を複数クローン樹立した。
2. PBMC由来hiPSCの未分化性の評価：上記方法にて誘導されたPBMC由来hiPS細胞各クローンにおける未分化マーカー遺伝子および蛋白発現をRT-PCR法および蛍光免疫染色法にて検討した。
3. PBMC由来hiPS細胞の分化多能性の評価：PBMC由来hiPS細胞各クローンにおける分化多能性をin vitroおよびin vivoにて評価した。
4. 口腔癌患者PBMC由来hiPS細胞のセルバンク化：樹立したhiPS細胞を気相窒素タンクに保存し、口腔癌患者由来iPS細胞の供給および活性化リンパ球への誘導ソースとして、凍結保存・細胞バンキングなどを行っている。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

口腔癌患者から採取したPBMCを、無血清培地RD6FにIL-2を添加した培地にて初代培養を行う。増殖した活性化リンパ球にセンダイウイルスベクターSeVdpを用いて初期化4遺伝子を導入することで、インテグレーションフリー・無フィーダー・無血清培養条件でPBMC由来hiPSCの誘導方法を確立し、口腔癌患者由来血液細胞から簡便にiPS細胞の樹立・維持が可能となった。また同培養方法を用いて、口腔癌患者PBMC由来hiPSCのセルバンク化をすすめている。

今後の研究の推進方策

引き続き、口腔癌患者由来血液細胞からインテグレーションフリー・無フィーダー・無血清培養条件で誘導したPBMC由来hiPSCを用いて、PBMC由来hiPSCの活性化リンパ球への分化誘導法の検討を行う。胚様体形成法を用いフィーダー細胞フリー無血清培養系で造血前駆細胞を分化誘導し,それら細胞から活性化リンパ球への分化誘導を行う。さらに、分化誘導された活性化リンパ球の細胞傷害活性についてin vivoおよびin vitroでの評価を行う。

次年度使用額が生じた理由

（理由）
PBMC由来hiPSCの活性化リンパ球への分化誘導法の検討に着手すべく、PBMC由来hiPSCから胚様体形成法を用いフィーダー細胞フリー無血清培養系で造血前駆細胞の分化誘導を試みているが、各種成長因子やFactorの検討を行っている最中であるため、本年度使用額に残額が生じ、次年度使用額が生じた。
（使用計画）
今後は次年度繰越額を用いて、造血前駆細胞さらに、造血前駆細胞の活性化リンパ球への分化誘導法の検討および、hiPSC由来活性化リンパ球の細胞障害活性の検討を行う予定である。

研究成果

• [雑誌論文] Induction of integration-free human-induced pluripotent stem cells under serum- and feeder-free conditions. (2020)
  • 著者名/発表者名: Atsuko Hamada, Eri Akagi, Sachiko Yamasaki, Hirotaka Nakatao, Fumitaka Obayashi, Manami Ohtaka, Ken Nishimura, Mahito Nakanishi, Shigeaki Toratani & Tetsuji Okamoto
  • 雑誌名: In Vitro Cell Dev Biol Anim. 巻: 56(1) ページ: 85-95
  • DOI: https://doi.org/10.1007/s11626-019-00412-w
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Lymphokine-activated killer cellの細胞障害活性の誘導におけるインスリン及びコレステロールの機能解析 (2020)
  • 著者名/発表者名: 三島健史、谷亮治、松井健作、内迫香織、濱田充子、虎谷茂昭、岡本哲治
  • 雑誌名: 口腔組織培養学会誌 巻: 29(1) ページ: 11-12
  • 査読あり
• [雑誌論文] 骨吸収抑制薬関連顎骨壊死（ARONJ：anti-resorptive agent-related osteonecrosis of the jaw）患者に生じた深頸部感染症の3例 (2019)
  • 著者名/発表者名: 山崎 佐知子、虎谷 茂昭、内迫 香織、田口 有紀、吉岡 幸男、岡本 哲治
  • 雑誌名: 日本口腔科学会雑誌 巻: 68 ページ: 226～231
  • DOI: https://doi.org/10.11277/stomatology.68.226
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] 疾患特異的induced pluripotent stem cell (DS-iPSC)の樹立と疾患研究 (2019)
  • 著者名/発表者名: 中瀬洋司，濱田充子，中峠洋隆，大林史誠，山崎佐知子，畑毅，北村直也，山本哲也，虎谷茂昭，岡本哲治
  • 雑誌名: 口腔組織培養学会誌 巻: 28 ページ: 23-24
  • 査読あり
• [雑誌論文] Adolescent and Young Adult（AYA）世代（における）口腔がんの臨床的検討 (2019)
  • 著者名/発表者名: 吉岡 幸男、神田 拓、小泉 浩一、谷 亮治、林堂 安貴、笹原 妃佐子、伊藤 翼、佐渡 友浩、石田 康隆、岡本 康正、小林 雅史、坂上 泰士、坂本 哲彦、明見 能成、虎谷 茂昭、岡本 哲治、松井 健作、津島 康司、大林 史誠、濱田 充子、山崎 佐知子、浜名 智昭、角 健作
  • 雑誌名: 日本口腔科学会雑誌 巻: 68 ページ: 20～27
  • DOI: https://doi.org/10.11277/stomatology.68.20
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] 90歳以上の超高齢口腔がん患者の臨床的検討 (2019)
  • 著者名/発表者名: 坂上 泰士、神田 拓、小泉 浩一、谷 亮治、林堂 安貴、笹原 妃佐子、伊藤 翼、佐渡 友浩、石田 康隆、岡本 康正、小林 雅史、吉岡 幸男、坂本 哲彦、明見 能成、虎谷 茂昭、岡本 哲治、松井 健作、津島 康司、大林 史誠、濱田 充子、山崎 佐知子、浜名 智昭、角 健作
  • 雑誌名: 日本口腔科学会雑誌 巻: 68 ページ: 12～19
  • DOI: https://doi.org/10.11277/stomatology.68.12
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] 無血清培養系を用いた扁平上皮癌細胞株からの放射線耐性細胞の樹立とその機能解析. (2019)
  • 著者名/発表者名: 濱田充子, Nguyen Quang Tam,内迫香織,中瀬洋司,中峠洋隆,虎谷茂昭,岡本哲治.
  • 雑誌名: 口腔組織培養学会誌 巻: 28(1) ページ: 33-34
  • 査読あり
• [学会発表] 当科における10年間の唾石症患者に関する臨床的検討 (2019)
  • 著者名/発表者名: 中瀬洋司，浜名智昭，坂上泰士，山崎佐知子，角 健作，神田 拓，小泉浩一，谷 亮治，林堂安貴，虎谷茂昭，岡本哲治
  • 学会等名: 第29回日本口腔内科学会、第32回日本口腔診断学会、第12回日本口腔検査学会、第30回日本臨床口腔病理学会
• [学会発表] 当科で治療を行った深頸部膿瘍の3例 (2019)
  • 著者名/発表者名: 吉岡幸男，佐藤成紀，大林史誠，櫻井繁，山崎佐知子，浜名智昭，小泉浩一，虎谷茂昭，岡本哲治
  • 学会等名: 第29回日本口腔内科学会、第32回日本口腔診断学会、第12回日本口腔検査学会、第30回日本臨床口腔病理学会
• [学会発表] 当科における過去12年間の顎下膿瘍に関する臨床的検討 (2019)
  • 著者名/発表者名: 高橋秀明，山崎佐知子，吉岡幸男，松井健作，坂上泰士，浜名智昭，神田 拓，小泉浩一，谷 亮治，林堂安貴，虎谷茂昭，岡本哲治.
  • 学会等名: 第29回日本口腔内科学会、第32回日本口腔診断学会、第12回日本口腔検査学会、第30回日本臨床口腔病理学会
• [学会発表] 当科および関連病院における骨吸収抑制薬関連顎骨壊死（antiresorptive agent related osteonecrosis of the jaw: ARONJ)の臨床的検討 (2019)
  • 著者名/発表者名: 林靖也，吉岡幸男，坂上泰士，山崎佐知子，浜名智昭，角健作，神田拓 ，小泉浩一 ，谷 亮治，林堂安貴，虎谷茂昭，伊藤奈七子，岡本康正，鷹津冬良，伊藤 翼，石田康隆，佐渡友浩，中峠洋隆，小林雅史，坂本哲彦，明見能成，岡本哲治
  • 学会等名: 第67回NPO法人日本口腔科学会中国・四国地方部会
• [学会発表] Establishment and Characterization of Disease-specific Human iPSCs in Serum-, Integration- and Feeder-free Cultures. (2019)
  • 著者名/発表者名: ATSUKO HAMADA, Y. Nakase, F. Obayashi,T. Fukutani, H. Nakatao, E. Sakaue, S. Yamasaki, T.Kanda, K. Koizumi, Y. Yoshioka, R. Tani, S. Toratani,J. D. Sato, and T. Okamoto
  • 学会等名: in vitro bilogy meeting 2019
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] 無血清培養系での口腔癌由来細胞株の樹立 (2019)
  • 著者名/発表者名: 濱田充子,佐藤成紀,内迫香織,中瀬洋司,大林史誠,中峠洋隆,山崎佐知子,谷 亮治,虎谷茂昭,岡本哲治
  • 学会等名: 第73回NPO法人日本口腔科学会学術集会
• [学会発表] 無血清オーガノイド培養法を用いたマウス iPS 細胞からの顎顔面頭部組織の誘導 (2019)
  • 著者名/発表者名: 大林史誠，濱田充子，佐藤成紀，中峠洋隆， 山崎佐知子，岡本哲治
  • 学会等名: 第73回NPO法人日本口腔科学会学術集会
• [学会発表] 基底細胞母斑症候群（NBCCS）の変異解析 及びインテグレーションフリー・フィー ダーフリー・無血清培養系でのNBCCS 特異的iPSC の樹立 (2019)
  • 著者名/発表者名: 中瀬洋司，濱田充子，中峠洋隆，大林史誠， 山崎佐知子，畑毅，北村直也，山本哲也， 虎谷茂昭，岡本哲治
  • 学会等名: 第73回NPO法人日本口腔科学会学術集会
• [学会発表] A clinical study of elderly patients over 91 years old with oral malignancies. (2019)
  • 著者名/発表者名: Taishi Sakaue, Yukio Yoshioka, Fumitaka Obayashi, Kouji Tsushima, Kensaku Matui, Atsuko Hamada, Sachiko Yamasaki, Tomoaki Hamana, Kensaku Sumi, Taku Kanda, Koichi Koizumi, Ryojani, Yasutaka Hayashidou, Hisako Sasahara, Shigeaki Toratani, Tetsuji Okamoto
  • 学会等名: The 51th Annual Meeting of Hiroshima University Dental Society
• [学会発表] A clinical study on Adolescent and Young Adult (AYA) patients with oral cancer. (2019)
  • 著者名/発表者名: Y. YOSHIOKA, T. SAKAUE, K. MATSUI, K. TSUSHIMA, F. OBAYASHI, A. HAMADA, S. YAMASAKI, T. HAMANA, K. SUMI, T. KANDA, K. KOIZUMI, R. TANI, Y. HAYASHIDO, H. SASAHARA, S. TORATANI, T. OKAMOTO
  • 学会等名: The 51th Annual Meeting of Hiroshima University Dental Society
• [学会発表] 無血清培養系を用いた扁平上皮癌細胞の放射線耐性獲得機構の細胞内分泌学的 機能解析 (2019)
  • 著者名/発表者名: 内迫香織,濱田充子,三島健史,松井健作,谷亮治,虎谷茂昭,岡本哲治
  • 学会等名: 第73回NPO法人日本口腔科学会総会
• [学会発表] 口腔扁平上皮癌におけるhuman papilloma virus（HPV）16の関与 (2019)
  • 著者名/発表者名: 林 靖也, 虎谷茂昭，中峠洋隆，松井健作，福谷多恵子，濱田充子，吉岡幸男，谷亮治，岡本哲治
  • 学会等名: 第73回NPO法人日本口腔科学会総会
• [学会発表] 口腔原発神経内分泌癌由来細胞株の樹立 -初代培養腫瘍細胞の増殖様態から診断されるに至った口腔原発神経内分泌癌- (2019)
  • 著者名/発表者名: 佐藤成紀,濱田充子,櫻井 繁,浜名智昭,虎谷茂昭,岡本哲治.
  • 学会等名: 第73回NPO法人日本口腔科学会総会
• [学会発表] 集学的治療が奏功した口腔原発神経内分泌癌の1例 (2019)
  • 著者名/発表者名: 櫻井 繁,浜名智昭,佐藤成紀,濱田充子,虎谷茂昭,岡本哲治
  • 学会等名: 第73回NPO法人日本口腔科学会総会
• [学会発表] 口腔癌患者における腸内ならびに口腔内細菌叢の多様性解析 第二報 (2019)
  • 著者名/発表者名: 松井健作,谷亮治,濱田充子,虎谷茂昭,大友剛,徳丸浩一郎,岡本哲治
  • 学会等名: 第73回NPO法人日本口腔科学会総会
• [学会発表] Lymphokine-activated killer細胞の細胞障害活性の誘導に及ぼすコレステロール合成阻害剤の影響 (2019)
  • 著者名/発表者名: 三島健史, 谷 亮治, 松井健作, 内迫香織, 濱田充子, 虎谷茂昭, 岡本哲治
  • 学会等名: 第73回NPO法人日本口腔科学会学術集会