| 研究課題/領域番号 |
18K09735
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| 研究機関 | 大阪医科大学 |
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研究代表者 |
平田 あずみ 大阪医科大学, 医学部, 准教授 (40263587)
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| 研究分担者 |
高野 和文 京都府立大学, 生命環境科学研究科, 教授 (40346185)
田中 俊一 京都府立大学, 生命環境科学研究科, 准教授 (70591387)
野村 良太 大阪大学, 歯学研究科, 准教授 (90437385)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | コラーゲン結合タンパク質 / Streptococcus mutans / 機能解析 / 構造解析 |
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| 研究実績の概要 |
コラーゲン結合タンパク質Cbmは、Streptococcus mutansの4つの血清型のうちわずか5％のk型S. mutansが菌体表層に発現する。Cbmはコラーゲン結合ドメイン (CBD)、機能未知のB-repeats領域、細胞壁結合LPXTGモチーフで構成されており、このうちCBDは主にコラーゲンと結合する部位で、構造的に類似したN1、N2それらをつなぐLinkerとC末端のLatchからなる。本年は新たに2種の変異体を作製し、これまでに作製されたCbm_CBDの各領域変異体と合わせた計19種の変異体について、コラーゲン結合活性測定と熱変性測定を行うことで、Cbm_CBDのコラーゲン結合や構造安定性における各領域の役割を明らかにすることに取り組んだ。コラーゲン結合活性測定において、N1もしくはN2のみではコラーゲンとの結合活性を示さなかったのに対し、N1-や-N2, N2~のようにN1, N2にWTの配列の順番でLinker, Latchを付加した変異体では高い結合活性を示した。よって、LinkerやLatchがN1とN2のコラーゲン結合を補完していると思われる。また、熱変性測定において、N1よりもN2のほうが構造的に安定であることから、N2は安定性にも重要であると考えられる。さらにN1が欠損しても安定性が変化しなかったのに対し、LinkerやLatchの欠損では安定性がわずかに低下することから、LinkerとLatchはN1やN2の構造安定性を補助していると示唆される。以上の結果より、N1はCbm_CBDにおける機能に寄与し、N2は機能および構造の両方において中心的役割を担い、Linker, LatchがN1, N2を補強していることが明らかとなった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
① Cbm_CBDをN1-N2~ (WT)と表記し、例えばLatch欠損変異体をN1-N2、N1とLinkerのみ変異体をN1-とする。今回新たにN1~、-N2のドメイン変異体2種を作製した。
②これまでに作製したCbm_CBDの19種の変異体タンパク質は、Cbm_N1-N2~、Cbm_N1、Cbm_N1-、Cbm_N1-N1、Cbm_N1N1、Cbm_N1-N1~、Cbm_N1-N2、Cbm_-N2~、Cbm_N2-N2~、Cbm_N2-N1~、Cbm_N2-N1、Cbm_N2-N2、Cbm_N2-、Cbm_N2N2~、Cbm_N2~、Cbm_N1N2~、Cbm_N2、N1~、-N2である。
③WTおよび19変異体タンパク質を用いて、ELISAによるコラーゲンとの結合活性測定、CDによるスペクトル測定および熱変性測定を行った。
④結晶獲得には至っていない。
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| 今後の研究の推進方策 |
①結晶化条件の見直しを行い、Cbm_N2-N2~の結晶化を継続する。
②N1非存在下でのN2とLatchとの関係を明らかにするため、Cbm_N2~の結晶化を行う。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
（理由）本年度は2変異体の新規作製と、それに引き続きコラーゲンとの結合活性測定とCDによるスペクトル測定および熱変性測定を行ったが、これらの実施には試薬等の購入の必要性が低かったことによる。
（使用計画）次年度は、数種類の変異体の結晶化を予定している。結晶化用の試薬は高価なものが多く、そのための経費として充当する予定である。
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