| 研究課題/領域番号 |
18K09778
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| 研究機関 | 日本歯科大学 |
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研究代表者 |
柳下 寿郎 日本歯科大学, 生命歯学部, 教授 (50256989)
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| 研究分担者 |
辺見 卓男 日本歯科大学, 生命歯学部, 助教 (20814883)
田谷 雄二 日本歯科大学, 生命歯学部, 准教授 (30197587)
添野 雄一 日本歯科大学, 生命歯学部, 教授 (70350139)
佐藤 かおり 日本歯科大学, 生命歯学部, 講師 (90287772)
荘司 洋文 日本歯科大学, 生命歯学部, 准教授 (90235713)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | 病理診断 / 口腔癌 / 扁平上皮癌 / 早期悪性病変 / 異型上皮 / 免疫組織化学 / 変異誘発モデル |
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| 研究実績の概要 |
病態診断の現状として、組織切除生検（組織診）は確定診断だが、侵襲性が高いうえ、組織採取時の刺激により病変の悪化（増殖亢進・転移など）を引き起こす懸念が指摘されている。粘膜の擦過によって得た細胞の形質を判定する細胞診は組織診と比べて低侵襲性である反面、組織構造の情報が得られないため主に悪性細胞の有無を探索するスクリーニング的な用途に制限される。申請者らは、組織診と細胞診の欠点を補った新しい診断システムとして、マイクロバイオプシーアレイの開発を構想している。この実現に向けて、本研究では、口腔粘膜上皮に潜む早期悪性病変を評価するための低侵襲性診断システムの開発を長期目標に掲げ、粘膜上皮微小片における異型形質プロファイリング法を確立することを目指している。
初年度では、本申請の端緒から継続している調査として、口腔癌（口腔粘膜の扁平上皮癌）の疑いで全摘切除された舌の組織診標本を対象として、細胞増殖活性、上皮細胞骨格、癌抑制遺伝子などの免疫組織化学的検索を行い、扁平上皮癌の素地となる異型上皮の分布について解析した。不断の刺激に晒されている口腔粘膜では、遺伝子変異が蓄積して広範囲で癌に移行しうる素地が形成されているとの概念に基づき、ケラチン細胞骨格分子（CK13、CK17）、増殖活性マーカー（Ki-67）、癌抑制因子p53の発現パターンを相互比較した結果、検体全域が広く陽性を示す症例、一部に限局した陽性領域を認める症例など、発現様式は症例毎に大きく異なっていたが、特にCK13陰性・Ki-67陽性領域とHE染色で判別可能な異型形質領域が高い相関を示すのに関し、p53発現との対応には複数のパターンが存在することを明らかにできた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
当初予定では、粘膜上皮表層部の上皮形質の判定に向けて、マウスに実験的に生じさせた異型上皮における遺伝子発現変化を調べる計画であったが、解析機器に不具合が生じたため、薬剤塗布・Ｘ線照射による変異誘発、機械的擦過による反応性異型上皮の作出実験は次年度以降に見送ることとした。本年度中では、動物試料作製の各ステップについて予備検討を追加して次年度実施への準備を整えること、また、多重免疫染色の精度を高めるための条件検討を優先して行った。
一方、申請期間を通した計画であるヒト手術検体の解析は順調に進めている。これまでに、舌癌疑いで全摘された検体試料を3 mm幅に割断、パラフィン包埋・薄切試料をサイトケラチン13（CK13）とKi-67の特異抗体による免疫染色に供し、上皮層領域を0.5mm幅の区画毎に発現パターンを4段階（健常相当～高度異型）にスコア化し、異型上皮の占有率・分布パターンを判定する手法を確立している。特に今回は、癌抑制遺伝子p53の発現パターンを検証し、検体全域が広く陽性を示す症例、一部に限局した陽性領域を認める症例などに分けられることが明らかとなった。HE染色による組織形態の所見と照らし合わせたところ、異型上皮分布との関連性に一定のパターンがあることが判明するとともに、p53分布パターンにはさらに未知の要因が関与している可能性が高いことが推察された。病理診断科において検体試料の確保を続けており、解析対象としている舌病変に加え、比較対照の歯肉病変、頬粘膜病変についても蓄積している。
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| 今後の研究の推進方策 |
初年度に引き続き、外科手術による組織診検体および細胞診検体を用いて異型マーカー発現の検索を行う。また、初年度に実施を予定していた変異誘発モデルマウスの作出と分子探索を進める。この目的に向けては、DNA損傷による変異原性を持つニトロキノリン（4-NQO）、フェニルイミダゾピリジン（PhIP）の継続投与、また、Ｘ線の局所照射を使用する。病変組織からは、凍結切片を作製してレーザーマイクロダイセクション（LMD）法により上皮表層部および基底部を切り取り、RNA精製・マイクロアレイ解析を実施、リアルタイムPCR・免疫染色で発現量・分布を検証する。マイクロアレイでの遺伝子発現データは、IPAソフトウェアによるパスウェイ解析に供する。病変部における表層と基底層の遺伝子発現およびタンパク検出の比較、また、薬剤非投与の対照群との比較により異型細胞の指標となる分子を検索する。薬剤投与実験では長期（約20週間）観察群も予定するため、Ｘ線照射による反応性異型病変の実験と併行する。
上記の実験モデルで得られたマーカー候補分子については、組織における発現分布の検証と局在パターンの相関分析を行う予定である。粘膜病変の対照として、口腔扁平苔癬などにみられる異型上皮についても腫瘍性異型上皮との相違を確認する。実験モデルを用いた上皮表層での異型鑑別の検証において有用な分子が同定できない場合、本申請の将来構想であるアレイデバイス（粘膜表層の微小回収とその採取位置を保持したままの解析）の実現に向けて、当該実験系での検体の回収条件（部位・細胞数）、標的分子検出条件の設定を計画する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
【理由】
初年度で予定していた変異誘発実験を機器不具合により見送ったため、実験に供する動物および病変組織の画像解析に要するコンピュータ・画像ストレージの購入が不要となった。
【使用計画】
変異誘発実験に供する動物の購入、ならびに画像解析用コンピュータと大容量ストレージ（NAS）の購入費として計上する。
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