| 研究課題/領域番号 |
18K09778
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| 研究機関 | 日本歯科大学 |
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研究代表者 |
柳下 寿郎 日本歯科大学, 生命歯学部, 教授 (50256989)
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| 研究分担者 |
辺見 卓男 日本歯科大学, 生命歯学部, 助教 (20814883)
田谷 雄二 日本歯科大学, 生命歯学部, 准教授 (30197587)
添野 雄一 日本歯科大学, 生命歯学部, 教授 (70350139)
佐藤 かおり 日本歯科大学, 生命歯学部, 講師 (90287772)
荘司 洋文 日本歯科大学, 生命歯学部, 准教授 (90235713)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | 病理診断 / 口腔癌 / 扁平上皮癌 / 早期悪性病変 / 異型上皮 / 免疫組織化学 / 変異誘発モデル |
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| 研究実績の概要 |
口腔粘膜の悪性腫瘍としては扁平上皮癌が最も多く、一般に口腔癌と呼ばれる。口腔癌の病理診断には切除病変の組織診が必須であるが、外科切除時の組織侵襲が病変の進展や転移を引き起こす可能性がある。粘膜の擦過細胞診は、組織診と比べると侵襲性が低いものの、組織構造の情報が得られないため悪性細胞の有無を探索するスクリーニング的な用途に制限される。本研究では、組織診と細胞診の欠点を補った新しい診断システムとなるマイクロバイオプシーアレイ（仮称）の開発を長期目標として、口腔粘膜上皮微小片における異型形質プロファイリング法の確立を目的としている。
これまでに、口腔癌の疑いで全摘切除された舌の組織診標本を対象として、上皮細胞骨格マーカー（サイトケラチン；CK13、CK17）、増殖活性マーカー（Ki-67）、癌幹細胞マーカー（CD44、Bmi-1）、癌抑制因子p53の免疫組織化学的検索を行い、ヘマトキシリン・エオジン（H-E）染色で判別可能な異型上皮領域と各種マーカー陽性細胞局在との相関や発現分布パターンの多様性を明らかにしてきた。
今年度は、これらの癌形質プロファイルを複合的に捉え、口腔扁平上皮癌の浸潤様式分類（山本・小浜分類〈YK分類〉、Pattern of infiltrating growth〈INF〉、簇出、Worst Pattern of Invasion-5〈WPOI-5〉）に基づいた病型との関連性に加えて、健常相当上皮→過形成上皮→異型上皮（上皮性異形成）の異型形質獲得プロセスに沿った発現変化を再整理することができた。
最終年度に向けて、どのようにして実際の粘膜組織の位置情報を維持したまま上皮形質の変遷を解析できるかについて検討を続けている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
年度初頭からのCOVID-19拡大の影響に加えて、本研究計画で使用しているレーザーマイクロダイセクション装置が経年劣化し、計画していた実験は大幅に予定変更せざるを得なかった。動物モデルを使用した実験は中止し、これまでに確保しているヒト症例を用いたマーカー分子発現の再整理を中心に組織所見の検索を行った。
粘膜上皮に生じる悪性形質変化について、ごく初期の促進要因の有無を確かめる目的で、初期表在性病変としてpT1/T2相当の舌扁平上皮癌の浸潤様式分類（YK分類，INF，簇出，WPOI-5）と異型上皮形質の発現様式との関連性について詳しく追究した。その結果、リンパ管侵襲、静脈侵襲、神経周囲浸潤などの病理組織学的因子は、YK-4C、INFc、簇出5個以上、WPOI-5陽性と判定された各群においてその他の判定群より有意に高率であることが判明した。特にWPOI-5では、他の浸潤様式では抽出できない独立した生物学的要因が含まれている可能性が高く、想定される癌幹細胞形質との関連について追試している。
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| 今後の研究の推進方策 |
これまでの外科切除検体を用いた異型マーカー発現プロファイルを最終統合・整理する。変異誘発モデルについては、実験期間が限られているが、次回申請の研究計画に繋げられるよう可及的に変異原性を持つニトロキノリン、フェニルイミダゾピリジンの継続投与での変異誘発条件の検討を進める。薬剤投与後の長期観察は最終年度のため難しいが、炎症の慢性経過（～８週）を追跡できるエンドポイントを設定する。病変組織からは、上皮表層部および基底部を顕微切断し、RNA精製・マイクロアレイ解析を実施、リアルタイムPCR・免疫染色で発現量・分布を検証する（レーザーマイクロダイセクションに関しては、機器メーカーのデモ機借用を検討している）。マイクロアレイでの遺伝子発現データは、IPAソフトウェアによるパスウェイ解析に供する。病変部における表層と基底層の遺伝子発現およびタンパク検出の比較、また、薬剤非投与の対照群との比較により異型細胞の指標となる分子を検索する。これらの試料準備においては、本申請の将来構想であるマイクロバイオプシーアレイの解析用デバイス（粘膜表層の微小回収とその採取位置を保持したままの解析）の実現に向けて、検体の回収条件（部位・細胞数）、標的分子検出限界等の条件検討を行う。以上の実験モデルで得られたマーカー候補分子については、順次粘膜組織における発現分布の検証と局在パターンの相関分析を行っていく。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
【理由】前年度に見送った変異誘発実験がさらにCOVID-19拡大の影響で実施できなかったため、実験動物の購入が不要となった。
【使用計画】変異誘発実験に供する動物の購入費とマイクロアレイ解析費用として計上する。
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