| 研究課題/領域番号 |
18K09822
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| 研究機関 | 明海大学 |
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研究代表者 |
福田 正勝 明海大学, 歯学部, 講師 (10311614)
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| 研究分担者 |
坂下 英明 明海大学, 歯学部, 教授 (10178551)
大森 喜弘 明海大学, 歯学部, 教授 (50194311)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | 口腔癌 / p53 / 脂肪酸合成酵素（FAS） / SREBP / 細胞死 / Resveratrol |
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| 研究実績の概要 |
1.明海大学病院にて治療を受けた10例の口腔扁平上皮癌患者の生検組織のホルマリン固定パラフィン包埋材料について，まずHE染色標本にて病理診断を行った後，p53抗体，抗FAS抗体および抗SREBP抗体を用いた免疫組織化学的検索を行い，その発現強度および局在を確認した．その結果，6例（60%）の腫瘍細胞の核にp53タンパク質の陽性反応を認めた．また7例（70％）の腫瘍細胞の細胞質にFAS発現を認め，p53陽性症例全例においてFASの陽性所見が認められた．
2.5種類のヒト頭頸部扁平上皮癌培養株HSC-2，HSC-3，HSC-4，Ca9-22およびSAS細胞における，FASとSREBPの遺伝子ならびにタンパク質の発現状況をReal time qRT-PCR法およびWestern blot法にて確認した．その結果，各細胞株においてFAS mRNAおよびSREBP mRNAの自発的な発現を確認した．また，Ca9-22細胞において最も強いFAS mRNAおよびSREBP mRNAの発現量を示し，タンパク質についても同様であった．また，このCa9-22細胞をSREBP small interfere (si) RNAを用いてノックダウンした際，FASの発現は抑制され，この際のCa9-22細胞の増殖活性は明らかに抑制され，細胞数の減少が認められた．以上の結果から， p53遺伝子変異株であるCa9-22細胞において，SREBPの過剰発現を引き起こし，その結果，脂肪酸合成酵素であるFASの発現が増強されていることが示唆された．ここでTNF-alphaの刺激によってSREBPの活性が増強されるという報告があることから，Ca9-22細胞をTNF-alpha（10 ng/ml）にて経時的に刺激した際のSREBPタンパク質の細胞質から核への移行動態をProteoExtractキットを用い検索途中である．
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
ProteoExtract，ルシフェラーゼレポーターアッセイのためのパイロットスタディにおいて，思うようなデータが出ないまま時間と労力を費やしてしまったが，ようやく安定したデータが出だしたので，次年度からは当初の計画以上の達成度が得られるものと考えている．
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| 今後の研究の推進方策 |
①引き続いて，多数の口腔扁平上皮癌の生検組織材料を用いて，免疫組織化学的にp53，FASおよびSREBPの発現強度および局在を確認する．これらの結果と個々の症例の臨床病理学的諸因子との相関関係について解析を行う．
②FASおよびSREBPの発現増強が認められたヒト口腔扁平上皮癌由来細胞株Ca9-22を用い，in vitroの系で研究を行う．ここで，TNF-alphaの刺激によってSREBPの活性が増強されるという報告があることから，Ca9-22細胞をTNF-alpha（10 ng/ml）にて経時的に刺激した際のSREBPタンパク質の細胞質から核への移行動態をProteoExtractキットを用い検索すると共に，核DNAと結合したSREBPが活性化して機能しているか否か証明するために，この細胞株を用いてSREBPの活性動態をルシフェラーゼレポーターアッセイにて解析する．SREBPの活性化が証明されたCa9-22細胞にFASの活性阻害剤として知られる抗酸化剤・ポリフェノールの1つで抗腫瘍活性，抗炎症作用，酸化ストレスからの保護といった多くの作用を持つ天然物質Resveratrolを作用させる，あるいはFASのノックダウンを行いSREBPの活性動態を同様にして解析する．ヌードマウスにCa9-22細胞を播種・腫瘍形成した後，Resveratrolを濃度と時間をそれぞれかえて直接作用させた際のSREBPおよびFASの活性動態を同様に解析し，細胞死の検索と副作用の有無を形態的および組織学的に行う．
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| 次年度使用額が生じた理由 |
タイミングが合わなかった．
具体的には，当初から計画していたルシフェラーゼレポーターアッセイを行なっていたが，最初はなかなか良いデータが出なかった．そうこうしているうちに，年度末が近づいてきた．ちょうど良いデータが出だしたので，もう１セット購入しようと考えたが，年度を超えてしまう時期に来ていたので次年度に回した．その結果，22,242円という次年度使用額が発生してしまった．しかし，ようやく安定したデータが出だしたので，次年度からは当初の計画以上の達成度が得られるものと考えている．このため，この次年度使用額はすぐに使い切ることが予想される．
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