| 研究課題/領域番号 |
18K09833
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| 研究機関 | 広島大学 |
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研究代表者 |
麻川 由起 (丹根由起) 広島大学, 医歯薬保健学研究科(歯), 助教 (50526241)
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| 研究分担者 |
谷本 幸太郎 広島大学, 医歯薬保健学研究科(歯), 教授 (20322240)
國松 亮 広島大学, 病院(歯), 講師 (40580915)
廣瀬 尚人 広島大学, 医歯薬保健学研究科(歯), 助教 (50611935)
粟田 哲也 広島大学, 医歯薬保健学研究科(歯), 助教 (90758179)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | Angptl2 / 軟骨細胞 / 変形性顎関節症 |
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| 研究実績の概要 |
6 週齢雄性ラットの下顎頭軟骨層より軟骨細胞を採取、培養し、現有する培養細胞伸展機 (Flexercell Strain Unit) を用いて過度な機械的負荷（15 kPa, 毎分30 分）を与える。過度な機械的負荷が培養軟骨細胞においてAngptl2 遺伝子発現を増加する結果はこれまでの実験により明らかである。今年度は、Angptl2 過剰発現および siRNA による発現抑制が軟骨基質代謝因子発現に及ぼす影響について検討を行った。
まず、CRISPR-dCas9 活性化プラズミドを用いて Angptl2 の活性化およびAngptl2 siRNAを遺伝子導入し発現抑制する。過度な機械的伸張刺激を負荷後、total RNAおよび蛋白を精製し、現有するサーマルサイクラー (Light cycler 350s) および近赤外蛍光イメージャー (Odyssey) を用いて、軟骨基質代謝因子 (MMPs, COX-2, Aggrecanase) 発現の検討を行ったところ、Angptl2過剰発現によりMMP-3,13,COX-2, Aggrecanase発現の上昇が認められた。また、炎症性サイトカイン発現については、IL-1ｂ,TNF-a発現が有意に上昇した。それに対し、siRNAによるAngptl2発現抑制は軟骨基質代謝因子および炎症性サイトカインの発現を抑制することが明らかとなった。さらに、リコンビナント Angptl2 を培養開始14日目のATDC５に添加したところ濃度依存的に軟骨基質代謝因子およびIL-1b,TNF-a発現が上昇することが明らかとなった。また、リコンビナントAngptl2の最適濃度1.0ug/mlと判断した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
CRISPR-dCas9 活性化プラズミドを用いて Angptl2 の活性化およびAngptl2 siRNAを遺伝子導入し発現抑制をする実験の条件検討で時間を要したため。
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| 今後の研究の推進方策 |
今後の研究は、Angptl2 活性化および発現抑制後、NF-kB および MAP キナーゼ（ERK, JNK, p38）活性の変化を Western blot 法にて分析する。さらに、インテグリン a5b1 中和抗体を用いて、Angptl2 のシグナリング経路へのインテグリンの関与について検証を行う予定である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
平成３１年３月１２日より産前休暇を取得したため、今年度の実験計画を全て行うことができなかったため。研究を再開した時点で、今年度行えなかったレセプターであるインテグリンa5b1の関与を検討するために、インテグリンa5b1中和抗体を用いて、Angptl2のシグナリング経路の解明を行う予定である。
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