| 研究課題/領域番号 |
18K09885
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| 研究機関 | 鹿児島大学 |
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研究代表者 |
山口 泰平 鹿児島大学, 医歯学域歯学系, 准教授 (80230358)
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| 研究分担者 |
五月女 さき子 長崎大学, 医歯薬学総合研究科(歯学系), 准教授 (20325799)
中野 由 鹿児島大学, 医歯学域鹿児島大学病院, 助教 (20779988) [辞退]
有馬 一成 鹿児島大学, 理工学域理学系, 准教授 (70332898)
小幡 純子 鹿児島大学, 医歯学域歯学系, 助教 (70759448) [辞退]
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | 誤嚥性肺炎 / 口腔常在菌 / 病原因子 / 線毛 / 感染 / レンサ球菌 |
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| 研究実績の概要 |
誤嚥性肺炎は高齢者、障害者さらには周術期の患者さんなどで重要な感染症の１つであり、本研究で対象にしているアンギノーサスグループレンサ球菌は代表的な原因菌の１つである。病原体と宿主組織との分子的な結合は感染の第一歩であり、相互の結合因子を同定して結合機構を解明することは感染予防、治療に際して重要である。以前に菌体表層の線毛様構造物が口腔で唾液因子と反応して初期感染に関与していることを明らかにした。本課題では口腔をリザーバーとして誤嚥による肺炎発症機構の解析を目的としている。前年度では菌体表層線毛の構成成分の１つであるSaf2（チップタンパク）が細胞のチューブリンタンパクと結合することを明らかにした。しかしチューブリンは肺に特異的なものではないことから、本年度ではさらに標的物質を同定すべくSaf2結合ビーズと親菌から精製した菌体表層線毛結合ビーズを用いてマウスの肺抽出液中の親和性物質の検出を何度か行ったところ、両方で分子量100Kda、120Kdaの物質が得られた。またSaf3、AgI/IIを結合したビーズでは確認できなかった。これらの物質はSaf2と精製線毛の両方で同定できたことから本菌の標的物質として有力な候補と考えられるが、これらは肺組織において含有量が高いため非特異的な結合である可能性は否定できず、さらなる検討が必要である。菌体側の成分では昨年度の実績でSaf2タンパクの中間の約100アミノ酸から構成される部分に結合部分があることが予想されたため、20アミノ酸からなるペプチドを５種類合成して、各々で結合の阻害実験を行ったところ、アミノ末端から２番目の領域で阻害効果を示した。この阻害効果は量依存性であった。上記の唾液成分との結合ではカルシウムイオンが結合に必須であったが、本反応では非依存的であった。このことから唾液成分との結合機構とは違う機序に寄っていると考えられた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
感染機構の解析のために細菌由来の表層タンパク３種類（Saf2, Saf3, AgI/II）を結合したプラスチックビーズの作成は順調に進み、マウス肺の抽出液を用いて親和性のある物質を精製、同定した。前年度には標的物質としてチューブリンタンパクを同定したが、この物質は肺特異的とは言い難いものであった。そこで今年度では新規に２つの物質を検出することができた。残念ながら量が少なく質量分析法による同定まで至っていない。現在分析が可能な程度に規模を大きくして進めているところである。手法は確立されたものであり、早晩同定ができるものと考えている。一方で細菌側の因子であるSaf2タンパクの結合部分として中央部分の約100アミノ酸配列に注目し、20アミノ酸からなる合成オリゴペプチドによる解析で狭い部分まで結合機能を限定できた。予定ではもう少し早い段階で宿主臓器側、細菌因子側の結合領域を同定しているはずであった。以上のことから「やや遅れている」という判断をしている。
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| 今後の研究の推進方策 |
上述のようにマウス肺由来の口腔レンサ球菌の標的物質はチューブリンの他に２つの物質を同定できるところまできている。これらは電気泳動上では肺に特異的である可能性が高く特異的な結合が期待できる。また細菌側の因子であるSaf2の結合部位を20アミノ酸まで絞り込めたことから結合機構の解析が可能になる。そこで当初の研究計画に沿ってコンピューターシミュレーションによる解析、ELISA法による古典的な実験による結合解析、表面プラズモン共鳴法による機器分析を行う予定である。これらのためには宿主側、細菌側因子の同定が前提であり、これを間違うと後の解析は意味をなさないため、現在は慎重に検証を進めているところである。一方で本菌は肝臓、脳、肺などで化膿性病変を作ることが知られている。肺では口腔からの誤嚥により侵入して病変を作ることが容易に推察できるが、肝臓、脳に感染する経路は疑問の余地がある。口腔レンサ球菌の中にはミーティスグループのような莢膜を有するものが存在し免疫不全者等では血流感染を引き起こすが、アンギノーサスグループはそのような性質を持たない。このため本菌では血流以外の感染経路を考慮するか、あるいは個人間で本菌に対して感受性に違いがあることが予想される。このことから本菌に由来する感染に対するリスクを判定することが重要である。2020年度は本課題の最終年度であることからSaf2蛋白を持つ菌の有無についての検証と、肺の標的物質の有無、変異に焦点を当てて臨床レベルでの解析を計画している。これにより宿主リスクを評価できることを期待している。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
物品費が残ってしまった。当該年度ではSaf2の中央領域に相当する合成ペプチドを合成して実験を実施するところまで進んだが、さらに予定していたアラニンスキャン法まで行けなかったことによるところが大きい。このため最終年度ではこれら一連の合成ペプチドに予算を投じる予定である。これらの解析が遅れてしまったために結合機構解析も後になっていることからその為の予算が次年度持ち越しになっている。学会他における研究打ち合わせ、公表は３回行うことができた。次年度でも同程度の頻度を予定していたがコロナウイルス感染症の関係で出張によるものは難しいかもしれない。しばらくはメール他の手段によるため、旅費は少なく計上すると思われる。
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