| 研究課題/領域番号 |
18K10121
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| 研究機関 | 杏林大学 |
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研究代表者 |
武市 敏明 杏林大学, 医学部, 助教 (90460360)
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| 研究分担者 |
塚 正彦 金沢大学, 医学系, 教授 (00272956)
北村 修 杏林大学, 医学部, 教授 (70266609)
桐生 京佳 杏林大学, 医学部, 准教授 (60555051)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | 覚醒剤 / ヒト / 脳 / 蛍光免疫染色 |
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| 研究実績の概要 |
濫用薬物において、覚せい剤の中毒死例等の極端な事例については、数多く報告されている。一方、濫用薬物である危険ドラッグは、年々その分子種が増加している。そのため、様々な分子種の存在する危険ドラッグの神経毒性についての研究は、分子種の増加に追いついていないのが現状である。その為、同様な薬理作用を持つ薬物の使用を、分子種を限定せずに明らかに出来る検査の開発は急務である。そこで、刺激性乱用薬物の1つである覚せい剤を用いた動物実験の成果を基に、ヒトへの応用及び、基本的な薬理作用が同様と考えられる薬物使用のスクリーニング検査について、実際の法医解剖例で検査しうる方法の開発を目指す。
本研究において法医解剖例より採取するサンプルは、刺激性薬物により放出されるドーパミン(DA)の神経終末の豊富な線条体、DA作動性神経の神経細胞体の位置する黒質、DA神経終末からのDA放出を制御するグルタミン酸(Glu)作動性神経の細胞体が位置しそのGlu作動性神経を制御する中脳のGABA作動性神経の投影先である視床とした。これらのサンプルに対して、神経細胞やグリア細胞のマーカー蛋白の発現状態を蛍光免疫染色法により解析する。しかしながら、前年度の研究において、法医解剖事例のサンプルを用いた蛍光免疫染色法による解析では、高輝度の自家蛍光によるバックグラウンドにより解析が困難であった。
そこで本年度は、バックグラウンドの低減を目的とし、自家蛍光を抑制する試薬(Glycine BufferまたはTrueVIEW Autofluorescence Quenching Kit)を用いた検討を行った。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
バックグラウンドの低減用試薬であるTrueVIEW Autofluorescence Quenching Kitの使用により、自家蛍光による強度のバックグラウンドは劇的に低減可能であった。しかしながら、前処理に用いている、リポフスチンの自家蛍光の低減試薬の作用の減弱を認めた。これらのことから、バックグラウンド全体での低減効果は弱いものの認められ、 画像処理を施す事によりデータ解析が可能となった。しかしながら、画像処理は出来うる限り行わないことが望ましいため、引き続き自家蛍光の低減方法や解析方法の検討が必要である。
また、 濫用薬物の事例が少なく、解析に適した組織試料の採取が困難であった。
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| 今後の研究の推進方策 |
引き続き、該当事例の収集に努める。さらに、画像処理を施す事無くデータの解析が行えるよう、バックグラウンドの低減方法を検討する。具体的には、自家蛍光が少ない波長領域を用いた蛍光色素による画像の取得を検討する。前述のバックグラウンド低減方法が上手くいかない場合は、パラフィン包埋ブロックから蛋白質を抽出し、これを試料としたWestern blotting法によるターゲットとなるマーカー蛋白質の半定量的解析や、mRNAの抽出を行い、Rial-time PCR法によるターゲットのmRNAの定量的解析を行う。
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