| 研究課題/領域番号 |
18K10822
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| 研究機関 | 国際医療福祉大学 |
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研究代表者 |
三宅 克也 国際医療福祉大学, 成田キャンパス基礎医学研究センター, 教授 (30219745)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2024-03-31
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| キーワード | 細胞膜損傷 / 細胞膜修復 / カルシウムイメージング / 細胞外小胞 / マイオカイン / 二光子レーザー / 膜融合 / 電子顕微鏡 |
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| 研究実績の概要 |
マイオカインとは筋線維から分泌される生理活性物質（サイトカイン）の総称である。生体内で骨格筋の5-30％が細胞膜損傷修復を繰り返している。aFGFとbFGF(FGF1,2)は筋線維に一様に存在し、細胞膜損傷によって細胞外へ大量に分泌される。しかし、その分泌機構は未だ不明でありマイオカインとしての機能も不明である。本研究では多光子顕微鏡を用いたライブイメージングによって、培養細胞およびマウス骨格筋線維からGFP-FGF1の分泌現象を高速・高解像レベルで捉えることに成功した。一方、細胞損傷液上清に全エクソソーム単離試薬を加え、透過型電子顕微鏡を用いて観察したが細胞外小胞はほとんど観察されなかった。またCal520、Rhod-4を用いて損傷修復細胞、それに接触する細胞、損傷していない細胞、さらに遠くの非接触細胞へとカルシウム波が広がる様子を確認した。さらに、損傷液や損傷液から抽出したヘパリン結合タンパク質、またはリコンビナントFGF1, 2を加えたところ、それぞれの時間(10-60s)でカルシウム波が広がる様子が確認できた。しかしながら、損傷液から抽出した全エクソソーム、IL-6、HGFには反応しなかった。細胞内ATPの漏れを指標にした細胞膜修復アッセイを行ったところ、FGF阻害剤プロタミンサルフェートは細胞膜修復を阻害した。これらの結果より、FGF1, 2は細胞膜修復に必要であり、細胞損傷シグナルを伝達するマイオカインであると考えられる。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
膜損傷時に分泌されるマイトカインとしてFGF１(aFGF)に注目し、損傷時のFGF1の細胞外への分泌を確認した。また、損傷時の小胞体から損傷膜への膜供給可視化に成功した。細胞内ATPの漏れを指標にした細胞膜修復アッセイを行ったところ、FGF阻害剤プロタミンサルフェートは細胞膜修復を阻害した。これらの結果より、FGF1, 2は細胞膜修復に必要であり、細胞損傷シグナルを伝達するマイオカインであると考えられた。これらの結果を国際学会にまで発表できたが、コロナ禍によって海外での共同実験ができず論文発表にまで至っていない。
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| 今後の研究の推進方策 |
マイオカインのGFP ベクターを作製し、マウスまたはヒト筋芽細胞へ遺伝子導入を行い、分化誘導させた筋管細胞を二光子レーザーで損傷しAiryscan でLive 観察を行う。作製したマイオカインGFP プラスミドを導入した細胞に、PHK67 蛍光リンカキットなど細胞外小胞を染め分けられる最新の染色法を用い、それらのマイオカインの分泌様式を多光子顕微鏡LIVE イメージングによって明らかにする。FGF ファミリー、Rab ファミリーで標識した膜移動、カルシウムに反応するアネキシンファミリー、様々なマイオカインの詳細な分泌形式を観察する。またこれらのベクターをドミナントネガティブ(DN)へ改変して機能的実験も行う。ウエスタンブロッティング、ELISA などを用いて、分泌物の生化学的タンパク解析も行う。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
コロナ禍のため実験が遅れたため。
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