| 研究課題/領域番号 |
18K10995
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| 研究機関 | 愛媛大学 |
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研究代表者 |
藤野 貴広 愛媛大学, 学術支援センター, 准教授 (40292312)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | アルツハイマー / アポＥ |
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| 研究実績の概要 |
アポＥ4は散発性アルツハイマー病の主要な危険因子である。しかし、散発性アルツハイマー病発症における役割については未だほとんど明らかにされていない。脳内におけるアポEはコレステロールなどの脂質と複合体を形成し、いわゆるアポE含有リポタンパク（アポE-nHDL）として存在し、アポEを認識する受容体を介して神経細胞に取り込まれると考えられている。
我々は、糖鎖修飾を受け、脳内に近い形のヒト・アポEをin vitro系で大量に得られる実験系を確立した。また、アポEにおける糖鎖修飾アミノ酸部位を同定し、そこへ置換変異を導入することで糖鎖修飾を受けないアポE変異体を得る事にも成功した。しかし、糖鎖修飾を受けないアポE 、特にアポE4は発現培地中のpH低下で容易に変成し、アポE4の発現低下及びアポE4からアポE4-nHDLへの変換効率を低下させる。そこで、アポE4を発現する培地にpH安定化剤及びタンパク質安定化剤を加えたところ大幅に発現効率を高めることが出来た。ところが、アポEからアポE-nHDLへ変換させるin vitro系ではその変換効率を上げることができなかったばかりか、これら添加剤が変換培地からアポE4-nHDLの精製を阻害することが明らかとなった。
我々はまた、アポE-nHDLを脳室内に注入することでin vivoにおけるアポEの動態を解析した。マウス脳室内に様々な濃度の蛍光標識アポE-nHDLを注入したところ、神経初代培養細胞とは異なり、in vivoにおいてアポE-nHDLは神経細胞にほとんど取り込まれないことが明らかになった。そこで、これまでの報告を参考に神経損傷モデルを使用する必要があると考え、様々な濃度のカイニン酸投与による海馬神経損傷モデルを作成し、同様の実験を行ったが、蛍光標識アポE-nHDLの神経細胞への取り込みは観察できなかった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
糖鎖修飾を受けないアポE変異体、その中でもアポE4は発現培地のpH低下で容易に変成し、発現量低下及びアポE4からアポE4-nHDLへの変換効率を低下させる。そこで、発現培地に様々なpH安定化剤及びタンパク質安定化剤を加えて試験したところ大幅に発現効率を高める条件を見出した。このため、アポE発現系のアデノウイルスによる大量発現系が構築できなかった場合に予定していた大腸菌で発現する方法の構築は回避することが出来た。ところが、アポEからアポE-nHDLへ変換させるin vitro系ではこれら添加剤が変換培地からのアポE4-nHDLの精製を著しく阻害することが明らかとなった。そのため、アポE-nHDLを脳室内に注入するのに十分な量を得られていないため、in vivoにおけるアポEの動態の解析が実施出来ていない。
これに加えて、マウス脳では神経初代培養細胞とは異なり、in vivoにおいて脳室内に注入したアポE-nHDLは神経細胞にほとんど取り込まれない。これまで神経損傷モデル動物では損傷を受けた神経にアポEが検出されることが報告されていることから、神経損傷モデルを作成し、脳室内に蛍光標識アポE-nHDLを注入することで、その取り込みを観察した。海馬神経破壊作用のあるカイニン酸を様々な濃度で投与することで神経損傷モデルを作成し、同様の実験を行った。しかし、アポE-nHDLの神経細胞への取り込みは観察できなかった。
上述の通り、研究は難航しており、当初の目標の半分程度しか達成できていない。
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| 今後の研究の推進方策 |
糖鎖修飾を受けないアポE変異体、その中でもアポE4からアポE4-nHDLへ変換させるin vitro系では脳室内に注入するのに十分な量のアポE4-nHDLが得られていないため、in vivoにおけるアポEの動態の解析が実施出来ていない。pH安定化剤は変換培地中に加えすぎると細胞毒性が上がり、又タンパク質安定化剤をプロテアーゼ阻害剤混合物では効果はあるものの費用がかかり過ぎるのが難点である。今後も脳室内に注入するのに十分な量のアポE4-nHDLが得られるin vitro系の条件を検討する。
現在最も困難だと思われる点は、マウス脳では神経初代培養細胞とは異なり、脳室内に注入したアポE-nHDLが神経細胞にほとんど取り込まれないことである。特に、カイニン酸による神経損傷モデルでのアポE-nHDLの神経細胞への取り込みが観察できなかったのは予想外である。というのも、神経細胞は定常状態ではほとんどアポE-nHDLを取り込まないが、神経細胞の増殖、神経突起の進展、損傷修復等の時には盛んにアポE-nHDLとしてコレステロールを要求することが示されている。また、脳虚血・再灌流モデルのスナネズミ海馬では、損傷を受けた海馬神経細胞に多量のアポEが沈着することが報告されている。さらに、ヒトの脊髄損傷でも、損傷を受けた部位の神経細胞にアポEの沈着が報告されているからである。カイニン酸による神経損傷モデルで良好な結果が得られなかったことから、再現性に不安を残すがドライアイスなどによる直接的な神経障害モデルを試みる。だだし、この方法は操作が煩雑であるため、各個体の障害レベルをコントロール出来ないため、再現性や定量性に不安を残す可能性がある。もし、ドライアイスによる直接的な神経障害モデルでもアポE-nHDLの取り込みが認められなかった場合は、in vivoによる実験系を放棄せざる負えないかもしれない。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
当初の研究計画通りの結果が得られず、その解決策も一部では得られたものの、抜本的対策にはならなかったために研究に遅延が生じ、次の研究段階に進めなかったため。可能な限り遅延を取り戻し、研究推進に努力する。
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