| 研究課題/領域番号 |
18K10995
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| 研究機関 | 愛媛大学 |
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研究代表者 |
藤野 貴広 愛媛大学, 学術支援センター, 准教授 (40292312)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | アルツハイマー / アポＥ |
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| 研究実績の概要 |
脳内でアポEはコレステロールなどの脂質と複合体を形成し、いわゆるアポE含有リポタンパク（アポE-nHDL）として存在し、アポEを認識する受容体を介して神経細胞に取り込まれると考えられている。
我々は、脳内に近い形の糖鎖修飾を受けたヒト・アポE及び糖鎖修飾を受けないアポE変異体の発現系を確立し、これらを大量に得る事に成功した。しかし、糖鎖修飾を受けないアポE 、特にアポE4は培養中の培地pHの低下で容易に変成し、アポE4の発現及びアポE4からアポE4-nHDLへの変換を低下させてしまう。そこで今年度は、培養条件を更に詳細に検討した結果、CO2濃度を細かく設定することでアポE4の発現及びアポE4からアポE4-nHDLへの変換効率を大幅に引き上げることが出来た。さらに、糖鎖修飾を受けないアポE4-nHDLを大量に得られたことで、これらを用いてリポタンパク受容体に対する結合親和性の解析を行った。その結果、糖鎖修飾はアポE-nHDLのリポタンパク受容体に対する結合と取込みに殆ど影響を与えないことが明らかになった。
我々はまた、アポE-nHDLを脳室内に注入することでin vivoにおけるアポEの動態を解析した。これまでの解析で、正常及びカイニン酸投与による海馬神経損傷モデルのマウス脳室内にアポE-nHDLを注入したが、神経細胞へのアポE-nHDLの取込みは観察されていない。そこで、今年度はドライアイスによる脳損傷モデルを作成し、脳室内に注入するアポE-nHDLの濃度、注入量、反応時間及び脳損傷後の修復期間のタイムコースなど、細かくパラメータを設定して同様の実験を行った。しかし、アポE-nHDLの神経細胞への取込みは全く観察されなかった。これらの結果は生体脳では、たとえ神経細胞が損傷を受けてもアポE-nHDLは殆ど取り込まない、若しくは極めて微量であることを示唆した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
糖鎖修飾を受けないアポE変異体、その中でもアポE4は発現培地のpH低下で容易に変成し、発現量低下及びアポE4からアポE4-nHDLへの変換効率を低下させる。そこで今年度は、CO2濃度を細かく設定することでアポE4の発現及びアポE4からアポE4-nHDLへの変換効率を大幅に引き上げることに成功した。糖鎖修飾を受けないアポE4-nHDLを大量に得られたことで、in vivoにおけるアポEの動態の解析に必要な十分な量のアポE-nHDLを得ることが出来た。この結果は、本研究を進める上で極めて重要なツール、アポE-nHDLの入手に成功したと言える。
一方、昨年度ではカイニン酸投与による海馬神経損傷モデルのマウス脳室内にアポE-nHDLを注入し、その動態を解析したが、神経細胞へのアポE-nHDLの取込みは観察されなかった。更に、今年度はドライアイスによる脳損傷モデルを作成し、細かくパラメータを設定して同様の実験を行ったがアポE-nHDLの取込みは全く観察されなかった。これらの結果は生体脳では、たとえ神経細胞が損傷を受けたとしてもアポE-nHDLは殆ど取り込まない、若しくは極めて微量であることを示した。
神経細胞は定常状態ではほとんどアポE-nHDLを取り込まないが、神経細胞の増殖、神経突起の進展、損傷修復等の時には盛んにアポE-nHDLとしてコレステロールを要求することが知られている。また、脳虚血・再灌流モデルのスナネズミ海馬では、損傷を受けた海馬神経細胞に多量のアポEが沈着することが報告されている。しかしこれまでの結果は、in vivoにおけるアポE-nHDL脳室内への注入による動態解析は極めて困難で、ノックインマウスの作成等による長期的な観察でなければ困難であることが示唆された。
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| 今後の研究の推進方策 |
今年度は、脳内に近い形の糖鎖修飾を受けたアポE及び糖鎖修飾を受けないアポE変異体より構成される十分な量のnHDLを得ることが出来たので、今後はこれを神経細胞に取り込ませ、その後のアポE及びアポE-nHDLの代謝やリサイクリング経路の解析をウェスタンブロティング、蛍光抗体法等で解析する。散発性アルツハイマー病の神経変成部位では古くからタウ蛋白が高度にリン酸化を受け、凝集体を形成している事が知られていることから、アポE4-nHDLを取り込ませた神経細胞のタウ蛋白のリン酸化状態を特異抗体を用いて観察する。同時に、家族性アルツハイマー病の原因遺伝子(アミロイドβ、β及びγセクレターゼなど)との機能的な関連を検討する。
近年、タウ凝集体形成を培養細胞内で再現するモデルが構築されており、線維化タウ蛋白のシードと共に家族性タウオパチー変異をもつタウ蛋白発現ベクターを神経由来の培養細胞（Neuro2aやSH-SY5Y細胞）に導入することで、タウ凝集体を細胞内に形成することができる。細胞内で線維化したタウはリン酸化されるため、抗リン酸化タウ抗体による確認やアミロイド染色による細胞内のタウ凝集を確認することが可能である。この方法の利点は煩雑な初代神経細胞の単離を必要とせず、広く使われている培養細胞が利用できるため、極めて効率や再現性の向上が見込まれると思われる。今後はこの解析法を導入し、アポE及びアポE-nHDLを同時に取り込ませた際のタウの変化を観察したいと考えている。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
当初の研究計画通りの結果が得られず、その解決策も一部では得られたものの、抜本的対策にはならなかったために研究に遅延が生じ、次の研究段階に進めなかったため。可能な限り遅延を取り戻し、研究推進に努力する。
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