| 研究課題/領域番号 |
18K10995
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| 研究機関 | 愛媛大学 |
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研究代表者 |
藤野 貴広 愛媛大学, 学術支援センター, 准教授 (40292312)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2024-03-31
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| キーワード | アポE / HDL / リポタンパク受容体 |
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| 研究実績の概要 |
アポＥ4は散発性アルツハイマー病の主要な危険因子であるが、アルツハイマー病発症における役割についてはほとんど明らかにされていない。脳内におけるアポEはコレステロールなどの脂質と複合体を形成し、いわゆるアポE含有リポタンパク（アポE-nHDL）として存在し、アポEを認識する受容体を介して神経細胞に取り込まれることでグリア細胞からコレステロールの供給を受けていると考えられている。
我々は、生体の脳内に近い形の糖鎖修飾を受けたヒト・アポE及び糖鎖修飾を受けないアポE変異体の発現系を確立し、これらを大量に得る事に成功した。さらに、In vitroにおいてこれらアポEをアポE-nHDLへと効率よく変換し、これを多量に得る方法を確立した。精製アポE-nHDLを様々な神経損傷モデルのマウス脳室内に注入し、その動態を解析したが、in vivoでの神経細胞へのアポE-nHDLの取込みは観察されなかった。一方、タウ蛋白は線維化タウ蛋白シードと共に家族性タウオパチー変異（hTau P301L）をもつタウ蛋白を神経由来の培養細胞（Neuro2aやSH-SY5Y細胞）などで発現するとタウ凝集体を細胞内に形成することが知られている。そこで家族性タウオパチー変異タウ蛋白を線維化タウ蛋白のシードと共に神経由来の培養細胞に発現させ、細胞内におけるタウ蛋白のリン酸化状態を観察した。アポE及びアポE-nHDLを同時に取り込ませた際のタウ蛋白の変化（線維化やリン酸化状態）を観察したが、アポE-nHDLを取り込んだ細胞でのタウ凝集体やタウ蛋白のリン酸化状態に変化は見られなかった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
4: 遅れている
理由
マウス脳室内に様々な濃度の蛍光標識アポE-nHDLを注入したところ、神経初代培養細胞とは異なり、in vivoにおいてアポE-nHDLは神経細胞にほとんど取り込まれないことが明らかになった。そこで、これまでの報告を参考に神経損傷モデルを使用する必要があると考え、様々な濃度のカイニン酸投与による海馬神経損傷モデルを作成し、同様の実験を行ったが、蛍光標識アポE-nHDLの神経細胞への取り込みは観察できなかった。
野生型のグリア初代培養細胞ではLDL受容体を発現しているにも関わらず、アポE３及びアポE4-nHDLの取り込みはほとんど観察されない。すなわち、生体脳の神経細胞でも同様のメカニズムでアポE -nHDLが取り込まれない可能性が考えられた。そこで、グリア細胞におけるLDL受容体の発現調節メカニズムやコレステロール生合成系の発現調節及びLDL受容体を強制発現させた場合のアポE -nHDLと取込みとコレステロール排出能を解析した。まず、海馬初代神経細胞におけるLDL受容体の発現調節では、培地中へのコレステロール添加によって発現は抑制され、除去によって発現は誘導された。これに一致して、海馬及び大脳皮質由来の神経初代培養細胞ではアポE３及びアポE4-nHDLを盛んに取り込むことが観察された。一方、グリア初代培養細胞から調整したアストロサイトでは培地中へのコレステロールの添加及び除去にLDL受容体の発現は全く影響を受けなかった。興味深いことに、このアストロサイトから分化するミクログリアではLDL受容体のコレステロールによる発現調節が観察された。また一方で、このアストロサイトにアデノウィルスを用いてLDL受容体を過剰発現させると、アポE３及びアポE4-nHDLを盛んに取り込むことが観察された。
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| 今後の研究の推進方策 |
グリア初代培養細胞由来のアストロサイトではLDL受容体を発現しているにも関わらずアポE３及びアポE4-nHDLの取り込みはほとんど観察されない。また、アストロサイトにおけるLDL受容体の発現はコレステロールによって調節を受けないことが明らかとなった。興味深いことに、このアストロサイトから分化するミクログリアではLDL受容体のコレステロールによる発現調節が観察された。また一方で、このアストロサイトにアデノウィルスを用いてLDL受容体を強制発現させると、アポE３及びアポE4-nHDLを盛んに取り込むことが観察された。これらの結果はアストロサイトにおけるコレステロール代謝やそれに関連する遺伝子群の発現調節などが神経細胞やミクログリアなどとは異なっていることを示唆している。また、LDL受容体などの細胞内輸送やリサイクリング経路なども異なっている可能性も考えられる。一方で、アストロサイトにLDL受容体を過剰発現させると、アポE３及びアポE4-nHDLを盛んに取り込むことが観察された。この結果は、LDL受容体の輸送経路や細胞表面への局在、アポE -nHDL結合後のエンドサイトーシス経路に問題がないことを示唆した。また、予備実験ではあるが、取り込まれたアポE -nHDL中のコレステロールは細胞内では殆どがコレステロールエステルへと変換され、ABCA1の発現誘導依存的にコレステロール排出が増加することが観察されている。すなわちアストロサイトにおける細胞内コレステロールの分配経路も正常であることが示唆されている。これらの結果を元に、今年度は更になぜアストロサイトはアポE -nHDL取り込まないのか？を詳細に解析する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
新型コロナ感染拡大の影響で研究に大幅な遅延が生じたため、本助成事業の期間延長を申請し、受理された。延長期間内に繰越額を使用する予定。
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