| 研究課題/領域番号 |
18K11074
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| 研究機関 | 島根県立大学 |
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研究代表者 |
原田 永勝 島根県立大学, 看護栄養学部, 准教授 (40359914)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | リードスルー治療 / 遺伝子変異疾患 / Duchenne型筋ジストロフィー / mdxマウス / 高脂肪食 / 筋組織 / ジストロフィン / ナンセンス変異 |
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| 研究実績の概要 |
ヒトの遺伝子変異疾患の約30％はmRNA上に異所性の翻訳停止コドン（PTC）が生じるナンセンス型である。ナンセンス型mRNAが細胞内のmRNA品質管理機構（NMD）により分解されるため、必要なタンパク質が作られず病気が発症する。ナンセンス型遺伝子変異疾患に対して、リードスルー治療研究が進んでいる。これは、mRNA上でリボソームがPTCを読み飛ばし翻訳を続行させる技術で、ナンセンス型mRNAから全長タンパク質を合成できる。細胞のNMDが活性化するとリードスルー効率は低下し、NMD活性が抑えられるとリードスルー効率は上昇する。本研究では、細胞のNMDおよびナンセンス型遺伝子のリードスルー治療に対する食生活の影響を明らかにすることを目的とした。実験にはDuchenne型筋ジストロフィーモデルであるmdxマウス（ジストロフィン遺伝子にナンセンス変異をもつ）を使用した。一般飼料あるいは高脂肪食で飼育したmdxマウスに対して、リードスルー治療を行った。対照として同系統の健常マウス（一般飼料飼育のみ）を用いた。リードスルー治療には研究例が多いリードスルー薬ゲンタマイシンを用いた。飼育期間中のマウスの体重、摂食量および血糖値（尾血）を測定した。飼育期間終了後にマウスから採血し、また、筋組織を採取し秤量後凍結保存した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
平成30年度は、研究代表者の所属研究機関の異動により、研究の立ち上げに時間を要したため、当初の予定からやや遅れた。
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| 今後の研究の推進方策 |
平成30年度に保存した筋組織サンプルを用いて、リードスルー治療の効率（全長ジストロフィンタンパク質の発現量）を解析する。筋タンパク質抽出サンプル中の全長ジストロフィン量をウエスタンブロット法により検討する。または、筋組織切片上の全長ジストロフィンを免疫染色する。また、マウス筋組織のNMD活性や小胞体ストレス反応（NMD活性に大きく関わる）の変化を解析する。NMD活性の測定方法として、定量的リアルタイムPCR法によるマーカー遺伝子のスプライシングバリアント解析（ナンセンス型／一般型mRNA発現量比を求める）や変異ジストロフィンmRNAの発現量解析を行う。小胞体ストレス反応は、XBP1経路、ATF6経路やPERK経路の変化を解析する（定量的リアルタイムPCR法やウエスタンブロット法）。血液解析により興味深い変化を示した血液中成分が得られれば、それをC2C12マウス骨格筋細胞株の培養液に再現し、NMD活性およびリードスルー治療効率に対する食事（食餌）の影響の分子メカニズムを解析する。培養細胞におけるNMD活性やリードスルー効率の測定には、ウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子を修飾したレポーター遺伝子（現有）を使用できる。NMD活性はマーカー遺伝子法（上述）によっても解析できる。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
［理由］平成30年度は、研究代表者の所属機関の異動により、研究の立ち上げがやや遅れながらも、研究費使用を無駄なく遂行できた。一方、研究計画の中心となる定量的リアルタイムPCR解析装置が異動先所属研究機関（現所属研究機関）にないことから、本年度研究費の一部を次年度に繰り越し、当該装置を次年度に購入する。
［使用計画］次年度に、定量的リアルタイムPCR解析装置を購入する。また、定量的リアルタイムPCR解析用試薬、タンパク質発現解析用試薬（各種抗体含む）、各種消耗品（サンプルチューブやウエスタンブロット用PVDFメンブレンなど）の購入を予定している。研究の展開状況に合わせて、培養細胞実験に関連する試薬や消耗品を購入する。
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