研究課題/領域番号 |
18K11638
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研究機関 | 名古屋大学 |
研究代表者 |
金尾 梨絵 名古屋大学, 環境医学研究所, 助教 (30542287)
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研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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キーワード | DNA損傷トレランス / 翻訳後修飾 / PCNA / DNA損傷 |
研究実績の概要 |
DNA損傷はDNA複製や転写などのDNA代謝反応の妨げとなる。DNA損傷トレランスはDNA損傷による複製阻害を回避する機構の総称で、DNA複製に必須の因子である、PCNA164番目のリジン(K164)の翻訳後修飾により複数のサブ経路が制御されている。ヒト細胞ではモノユビキチン化PCNAが損傷乗り越え複製(TLS)を制御することが知られているが、その他の翻訳後修飾がどのようなDNA損傷トレランスを制御するかはわかっていない。本研究計画ではヒト細胞において、ホモ3量体で機能するPCNAの3つのK164が全て翻訳後修飾されること(マルチ翻訳後修飾)により制御されるDNA損傷トレランス機構を明らかにすることを目的とし、解析を行っている。紫外線損傷に対しては、モノユビキチン化で制御されるTLSの寄与が大きく、PCNAのマルチ翻訳後修飾の要求性は高くない。そのため、本研究計画ではPCNAのマルチ翻訳後修飾を抑制した細胞株の解析から見出した、PCNAのマルチ翻訳後修飾の要求性が高いDNA損傷剤を用いて解析を進めている。 本年度はこのPCNAのマルチ翻訳後修飾の要求性が高いDNA損傷剤を細胞に曝露した場合、ヒト細胞において、どのような種類のPCNAの翻訳後修飾が誘導されるかを解析した。 また、このDNA損傷剤に対し、ノックダウンすることで細胞感受性が増加する因子の探索を行い、複数の候補因子を得た。これらの候補因子の発現抑制細胞を用いて、マルチ翻訳後修飾PCNAの要求性が高いDNA損傷剤に対する細胞感受性の検討、DNA複製への影響、PCNAの翻訳後修飾との関連などの解析を進めた。
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現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
PCNAのマルチ翻訳後修飾の要求性が高いDNA損傷剤に対してノックダウンすることで細胞感受性が増加する因子の探索を行い、複数の候補因子が得られるなど、おおむね順調に進んでいる。そのうちの1つの因子についてはノックアウト細胞の作成を試みたが、細胞増殖に必要な因子であったため、作成できなかった。しかし、siRNAを用いた感受性試験ではノックダウンして、PCNAのマルチ翻訳後修飾の要求性が高いDNA損傷剤に対して高感受性を示すことが確認できたため、この経路に関わる因子が得られたと考えている。その他に得られた因子に関しても発現抑制細胞の解析に着手しており、おおむね順調に進行していると考えている。
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今後の研究の推進方策 |
PCNAのマルチ翻訳後修飾の要求性が高いDNA損傷剤に対するDNA損傷応答経路に関与する可能性のある複数の因子を得た。これらの因子がマルチ翻訳後修飾を受けたPCNAが制御するDNA損傷トレランス経路に関与するかどうか検討し、その分子メカニズムを明らかにするため、解析を進めていく。また候補因子の1つに関してはすでにノックアウト細胞の作成を試みたが、細胞増殖に重要な因子であると考えられ、作出が困難であった。そのため、さらに複数のsiRNAを用いて実験を行う必要がある。また、siRNAに抵抗性のある発現コンストラクトを用意し、アドバックの実験を行う。他の候補因子に関しても、順次ノックアウト細胞の作出、発現抑制細胞を用いた実験を進めていく。
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次年度使用額が生じた理由 |
スクリーニングにより、PCNAのマルチ翻訳後修飾が制御するDNA損傷トレランス経路に関与する可能性のある因子を得たが、その候補因子のうちの1つは、ノックアウト細胞の作成が困難な遺伝子であった。そのため、複数のsiRNAを用いたノックダウン実験を中心に行う必要があるが、本年度はノックアウト細胞の作成を試みたため、次年度に複数のsiRNAを購入することになり、次年度使用額が生じた。また、ノックアウト細胞作出の試みにより、他の候補因子のノックダウン実験が次年度になり、それらに対する複数のsiRNA購入の費用が次年度になった。
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