DNA損傷応答蛋白質の網羅的インタラクトーム解析

2018 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 18K11639
• 研究機関: 名古屋大学
• 研究代表者: 黒谷 賢一 名古屋大学, 生命農学研究科, 研究員 (10402778)
• 研究分担者: 岡 泰由 名古屋大学, 環境医学研究所, 特任助教 (60762383) ; 荻 朋男 名古屋大学, 環境医学研究所, 教授 (80508317) ; 嶋田 繭子 名古屋大学, 環境医学研究所, 技術補佐員 (80623834) ; 唐田 清伸 名古屋大学, 環境医学研究所, 客員研究者 (90345017) [辞退]
• 研究期間 (年度): 2018-04-01 – 2021-03-31
• キーワード: DNA損傷応答 / インタラクトーム解析

研究実績の概要

DNA損傷応答 (DNA damage response, DDR)はゲノムの安定化に極めて重要な反応である。DDR蛋白質の細胞内での機能を理解するためには、蛋白質-蛋白質間の相互作用 (Protein-protein interaction, PPI)ネットワークを詳細に知る必要がある。本研究では、精密質量分析装置を利用した、ヒト細胞におけるDDR蛋白質の網羅的インタラクトーム解析を実施する。
2018年度は、インタラクトーム解析を生理的条件下で実施するために、ゲノム編集技術を利用し、標的遺伝子のC末端領域にタグ遺伝子配列と薬剤選択遺伝子配列の導入を検討した。タグ遺伝子には、導入確認を行うためのmClover配列を、インタラクトーム解析を実施するために、Strep配列を用いた。薬剤選択遺伝子を導入することで、クローニングのステップをスキップすることで、ハイスループットな解析が可能となることが期待される。細胞内で比較的高コピー数の蛋白質に関しては、ゲノム編集後の細胞を蛍光顕微鏡下で確認した際に、mCloverシグナルを確認することができた。しかしながら、低コピー数の蛋白質に関しては、ゲノム配列ではタグの挿入を確認できたにも関わらず、蛍光顕微鏡下ではmCloverシグナルを検出することができなかった遺伝子が複数見られた。標的遺伝子のC末端領域へのタグ付加により蛋白質の安定性が低下したことで、蛍光顕微鏡による検出限界に到達していないことが考えられる。

現在までの達成度 (区分)

3: やや遅れている

理由

網羅的インタラクトーム解析を内在性蛋白質に対して実施するために、ゲノム編集技術を利用した、mClover、Strep、薬剤耐性遺伝子の導入を検討したが、ゲノム配列ではタグ配列の挿入を確認できたにも関わらず、蛋白質の発現を検出することができなかった標的遺伝子が複数見られた。当初は、HDRによるゲノム編集技術を利用し、クローニングステップ不要な実験系を構築することで、ハイスループットな解析を実施することを計画していた。しかしながら、ゲノム編集技術を利用したハイスループットな、内在性蛋白質を標的としたインタラクトーム解析に加え、外来遺伝子 (cDNA導入により発現させた蛋白質)に対する解析を検討する必要性が出たため。

今後の研究の推進方策

2019年度は、生理的条件下でのインタラクトーム解析を目的とした、内在性遺伝子へのゲノム編集技術を用いたタグ付加反応を、昨年度に引き続き実施する。また、外来遺伝子を細胞へ導入し発現させた蛋白質に対しても、インタラクトーム解析の実施準備を行う。すでに作製済みのインタラクトーム解析用内在性遺伝子タグ付加された細胞に関しては、順次、精密質量分析装置を用いたインタラクトーム解析を実施する。Strepタグに対するプルダウンの条件、質量分析のためのサンプル調整に関しても、条件検討を実施する。DDR蛋白質のインタラクトーム解析により、新規蛋白質-蛋白質間相互作用、ならびに機能未知の蛋白質との相互作用が検出された際には、分子生物学的手法を用いた解析を実施する。具体的には、標的蛋白質に対する抗体を用いた免疫沈降法により、質量分析装置で得られた実験結果の確認を行う。また、機能未知蛋白質の細胞内で役割を検討するため、ゲノム編集技術により機能喪失させた細胞を作製し、DDRへの関与の有無を検討する。

次年度使用額が生じた理由

当初は、精密質量分析装置を用いたインタラクトーム解析を実施し、得られたデータを解析するために必要な物品の購入を予定していた。しかしながら、解析に十分なデータが得られず、次年度に使用することとしたため。

研究成果

• [雑誌論文] Functional Comparison of XPF Missense Mutations Associated to Multiple DNA Repair Disorders (2019)
  • 著者名/発表者名: Marin M, Ramirez MJ, Carmona MA, Jia N, Ogi T, Bogliolo M, Surralles J.
  • 雑誌名: Genes 巻: 10 ページ: 60～60
  • DOI: 10.3390/genes10010060
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Functional and clinical relevance of novel mutations in a large cohort of patients with Cockayne syndrome (2018)
  • 著者名/発表者名: Calmels N, Botta E, Jia N, Fawcett H, Nardo T, Nakazawa Y, Lanzafame M, Moriwaki S, Sugita K, Kubota M, Obringer C, Spitz MA, Stefanini M, Laugel V, Orioli D, Ogi T§, Lehmann A.
  • 雑誌名: Journal of Medical Genetics 巻: 55 ページ: 329～343
  • DOI: 10.1136/jmedgenet-2017-104877
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Cerebellar ataxia-dominant phenotype in patients with ERCC4 mutations (2018)
  • 著者名/発表者名: Doi H, Koyano S, Miyatake S, Nakajima S, Nakazawa Y, Kunii M, Tomita-Katsumoto A, Oda K, Yamaguchi Y, Fukai R, Ikeda S, Kato R, Ogata K, Kubota S, Hayashi N, Takahashi K, Tada M, Tanaka K, Nakashima M, Tsurusaki Y, Miyake N, Saitsu H, Ogi T, Aihara M, Takeuchi H, Matsumoto N, Tanaka F.
  • 雑誌名: Journal of Human Genetics 巻: 63 ページ: 417～423
  • DOI: 10.1038/s10038-017-0408-5
  • 査読あり
• [学会発表] Alterations in RNA polymerase IIo ubiquitination cause Cockayne syndrome-like premature aging phenotype in mice due to TC-NER defect. (2019)
  • 著者名/発表者名: Ogi T.
  • 学会等名: International Symposium on XP and other Nucleotide Excision Repair Disorders
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] Alterations in RNA polymerase IIo ubiquitination cause Cockayne syndrome-like premature aging phenotype in mice due to TC-NER defect. (2019)
  • 著者名/発表者名: Nakazawa Y, Ogi T.
  • 学会等名: International Symposium on XP and other Nucleotide Excision Repair Disorders
  • 国際学会
• [学会発表] ゲノム不安定性疾患群を中心とした希少難治性疾患の次世代マルチオミクス解析と難病プラットフォーム連携による疾患原因変異の検索. (2019)
  • 著者名/発表者名: 荻 朋男.
  • 学会等名: 難病プラットフォーム公開シンポジウム
  • 招待講演
• [学会発表] DNA損傷依存的なRNAポリメラーゼのユビキチン化修飾の異常はDNA修復経路の欠損マウスで老化表現型を示す. (2019)
  • 著者名/発表者名: 荻 朋男.
  • 学会等名: 国立遺伝学研究所・研究集会「ゲノムの維持継承を支える分子基盤の包括的理解とその発展」
  • 招待講演
• [学会発表] マルチオミクス解析により同定した重症アイカルディ・ゴーティエ症候群の分子病態解析. (2019)
  • 著者名/発表者名: 岡 泰由, 荻 朋男.
  • 学会等名: 第41回日本小児遺伝学会学術集会
• [学会発表] ゲノム不安定性を示す遺伝性疾患の分子病態. (2018)
  • 著者名/発表者名: 中沢由華, 荻 朋男.
  • 学会等名: 第3回名大医薬系3部局交流シンポジウム～岐阜薬科大学・岐阜大学G-CHAIN・ラクオリア創薬合同シンポジウム～
• [学会発表] RNAポリメラーゼのユビキチン化修飾による転写共役ヌクレオチド除去修復の反応制御とコケイン症候群の病態. (2018)
  • 著者名/発表者名: 荻 朋男.
  • 学会等名: 第41回日本分子生物学会年会
  • 招待講演
• [学会発表] Identification of pathogenic mutations in patients with rare diseases using multiomics approaches. (2018)
  • 著者名/発表者名: Oka Y, Ogi T.
  • 学会等名: Japanese Proteomics Society 2018 Conference (JPrOS 2018), 9th Asia-Oceania Human Proteome Organization (AOHUPO), and 66th Annual Conference on Mass Spectrometry
  • 国際学会
• [備考] 名古屋大学環境医学研究所HP
  • URL: http://www.riem.nagoya-u.ac.jp/index.html
• [備考] 名古屋大学環境医学研究所 発生遺伝分野HP
  • URL: http://www.riem.nagoya-u.ac.jp/4/genetics/index.html