| 研究課題/領域番号 |
18K11640
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| 研究機関 | 京都大学 |
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研究代表者 |
田野 恵三 京都大学, 複合原子力科学研究所, 准教授 (00183468)
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| 研究分担者 |
増永 慎一郎 京都大学, 複合原子力科学研究所, 教授 (80238914)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | DNA損傷修復 / 細胞内微細環境 |
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| 研究実績の概要 |
３０年度は、トリBリンパ細胞由来DT40細胞のFANC経路欠損細胞とTDP1欠損細胞がメトフォルミン（Metformin）に対して強い感受性を示すことについて詳細な解析を行うことを目指した。メトフォルミンによる致死効果がもたらされるDNA損傷の検出と定量を行う必要性から、再現可能かつ安定した実験系を作ることを第一目的として準備を進めた。FANC経路の主なターゲット損傷はDNA鎖間架橋（ICLs）だが、現在は技術的限界からICLsを定量する有効な手段は無い。この研究を開始する予備実験として、メトフォルミンに対するFANC経路欠損細胞群とTDP1の感受性が、フォルマリンに対する感受性と非常に類似している点に着目し、トポイソメラーゼDNAトラッピングの定量に加え、ICLsの修復系に依存する損傷であるDNAタンパク－クロスリンク（DPCs）との取得を試みた。フォルマリン処理によりDPCsが産生することは知られているので、フォルマリン処理後の細胞をセシウムクロライド密度勾配遠心法で分離精製した後、FITCでクロスリンクしたタンパクを標識した。この方法により安定的にDPCsの定量が可能となっている。また、ヒト細胞への解析系の移行のために、ヒトリンパ細胞由来のTK6細胞での遺伝子編集細胞については連帯研究者の笹沼博之博士の協力のもとfancc，fancl細胞の作製を終えた。これまで蓄積したトリ細胞での解析結果とヒト細胞での相違があるのか否かの確認を早急に行う。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
損傷定量の系が順調に取得出来ている。またヒト細胞の系への移行が連帯研究者の協力により確実に進んでいる。
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| 今後の研究の推進方策 |
メトフォルミンによるDNA損傷依存的致死作用は我々の報告以外に例は無い。これがトリ特異的な現象なのか、ヒト細胞にもみられる普遍的な応答なのかは不明な点ではある。現状で利用可能なTK6細胞遺伝子編集細胞を用いて致死作用の確認を行う。また昨年度に確立した複数の損傷定量系を用いて、DNA損傷の有無と実態の検索を行う。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
DPCsあるいはトポイソメラーゼトラップの継時的実験のためには、ラージスケールの培養が必須である。完全な技術獲得を前に今年度は小スケールでのトライアンドエラーを敢えて進め、実験材料消費の無駄を排し、その分次年度に予算を回す判断をした。次年度は今年度得た技術で大量培養による種々の欠損細胞を用いた継時的解析が行う予定である。
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