| 研究課題/領域番号 |
18K11642
|
|---|
| 研究機関 | 国立研究開発法人国立がん研究センター |
|---|
研究代表者 |
石合 正道 国立研究開発法人国立がん研究センター, 研究所, 施設長 (90298844)
|
|---|
| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2022-03-31
|
| キーワード | DNA損傷応答 / DNA修復 / フォーカス形成 / ATRIP / ATR |
|---|
| 研究実績の概要 |
放射線などにより生じるゲノム損傷は生体に取り有害であるため、生体にはその防御機構としてDNA損傷応答機構（DDR）が存在する。その中心分子はATMとATRキナーゼであるが、本課題ではATRに注目した。
DNA損傷応答によりDDR因子やDNA修復因子がDNA損傷部位に集積し、細胞核にドット状に局在することが知られている。これを（核内）フォーカスと呼ぶ。ATRはATRIPと複合体を形成し、DNA複製ストレスで活性化され、これまでに少なくとも2つの活性化機構が存在することが知られている。
研究代表者はATR-ARIPの活性化機構が他にも存在するのではないかと考え、新たなATR-ATRIP活性化を解析する目的で、ATRIP-GFPを安定に発現するヒト肺胞基底上皮腺癌細胞株A549細胞を用い、DNA複製ストレス下でのATR-ATRIP活性化の検出系を構築した。具体的には、複製ストレス条件下で、ATR-ATRIP活性化をATRIP-GFPのフォーカスとして、複製ストレスの初期反応を反映する1本鎖DNAの生成をその部位に結合するRPAフォーカスとして検出する系を構築した。この系を用い、複製ストレスを与える抗がん剤処理でsiRNAライブラリースクリーニングによって、ATRIP、RPAそれぞれのフォーカス形成効率に影響する候補分子を探索した。
1次スクリーニングとしてマイトマイシンC（MMC）24時間処理、2次スクリーニングとしてヒドロキシウレア（HU）2時間処理にて検討を行い最終的に56個の候補分子を得た。
これらの候補分子について発現プラスミドを構築し、発現細胞での検討を行っている。目的の候補分子はATRIP, RPAの挙動とよく一致することが期待されるが、予測する表現型を示す候補分子に行きついておらず、さらに検討を重ねている。
|
| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
候補分子について、個別の解析を行うためにcDNAを入手し、タグ付きの発現プラスミドを構築している。また、siRNAや抗体等の実験材料の入手を適宜進めている。コロナ禍による実験制限・実験自粛等が影響し、研究材料の取得、調達の遅延等が生じ全体のスケジュールに遅れが生じた。
発現プラスミドの構築が終了したものから発現細胞での検討を行っている。期待される候補分子はATRIP-ATRやRPAと動態が一致することが予測されるが、予測する表現型を示す候補分子に行きついておらず、未検討の候補分子の検討をさらに進める。
|
| 今後の研究の推進方策 |
1）候補分子の発現プラスミドの構築と細胞内局在、相互作用の検討
候補分子について、発現プラスミドを構築し、発現細胞における複製ストレス下での細胞内局在やフォーカス形成、ATRIPやRPAとの共局在を検討する。
２）候補分子のノックダウン・ノックアウト細胞の樹立と表現型解析。
個別の候補分子に対し、siRNAを用いたノックダウン細胞やCRISPER/CAS9システムによるnノックアウト細胞を構築する。樹立した細胞株を用い、DNA損傷応答やDNA修復の表現型解析を行う。まず様々なDNA損傷に対する感受性試験を行い、どのようなDNA損傷に欠損細胞が感受性を示すかその傾向を把握する。ノックダウンの方がノックアウトよりも容易に結果が得られることが期待されるため、ノックダウン細胞での検討を優先する。
現時点では6個の候補分子について検討したが、期待される表現型ではないので、さらに別の候補分子について検討を進める。
|
| 次年度使用額が生じた理由 |
次年度使用額が生じた理由。コロナ禍による実験制限・自粛や研究材料の取得、調達の遅延等の影響により実験の実施に遅れが生じ、研究費の利用額にも影響したため。
使用計画。主に物品費（消耗品）に使用する。
|
