| 研究課題/領域番号 |
18K11654
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| 研究機関 | 北海道大学 |
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研究代表者 |
東 恒仁 北海道大学, 医学研究院, 助教 (90453018)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | 不飽和カルボニル化合物 / 細胞傷害 / プロテインキナーゼC |
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| 研究実績の概要 |
本研究の最終目的は、環境中の毒性化合物である不飽和カルボニル化合物が、どのようにして細胞傷害を引き起こし、疾病につながっているかを解明することである。既に不飽和カルボニル化合物による細胞傷害には、プロテインキナーゼC（PKC）が深く関与していることを見いだし、報告していることから、本研究では主にPKCに着目して研究を進めることとした。2018年度は、不飽和カルボニル化合物がPKCの生化学的な性質に対する影響を調べることを目的とした。そして代表的な不飽和カルボニル化合物であるアクロレインがPKCを化学的に修飾することを示した。またPKCの様々な変異体を作製して解析をおこなったところ、化学修飾を受ける部位が特定のアミノ酸残基であることが判明した。続いて、PKCの生化学的な解析にあたり不可欠であるPKCの発現精製系の確立を試みた。PKCを大腸菌で発現させると封入体に移行することが知られていることから、昆虫細胞を用いた発現系を検討した。分泌シグナルの付加やPKCのリン酸化に関与するとされる別のキナーゼとの共発現など、様々な条件検討を実施したが、バキュロウイルスを用いた発現系では充分なPKCを得ることができなかった。これはPKCが昆虫細胞内の他のタンパク質と相互作用していることが原因ではないかと考え、無細胞発現系の適用を試みた。プロモーター及びリボソーム結合部位を付加したPKCのcDNAを精製リボソーム等とインキュベートしたところ、解析に用いることが可能な量のPKCの発現を確認することができた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
2018年度には、当初予定していた、不飽和カルボニル化合物によるPKCの化学的修飾に関する解析、ならびにPKCの発現系の構築に目処がついたことから、ほぼ当初の予定どおりに研究が進捗していると判断した。
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| 今後の研究の推進方策 |
2019年度以降には、PKCを介した不飽和カルボニル化合物の生体への作用に関する解析を進めるため、無細胞発現系で発現させたPKCの精製系の確立を試みる。精製されたPKCを用いてin vitroキナーゼ活性測定を実施し、不飽和カルボニル化合物がPKCの活性に与える影響に関する解析を試みる予定である。
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