| 研究実績の概要 |
本年度は、エチレングリコールからグリコールアルデヒドへ、グリコールアルデヒドからグリコール酸へ、そしてグリコール酸からグリオキシル酸へとそれぞれ変換させるために必要な３種の酵素について、第1, 2段階目の反応を触媒する酵素にtwin-arginine translocation(TAT)シグナルを付加し、3種の酵素全てを宿主である組換え大腸菌のペリプラズムに局在させることを試みた（第3段階目の反応を触媒する酵素はすでにペリプラズムに局在している）。その結果、TATシグナルを付加すると一方の活性が大幅に失活することが確認された。また、他のシグナルについても検討したが、同様に目的酵素全てをペリプラズムへ局在させることができなかった。
そこで、計画書に沿って、昨年まで行っていた第3段階目の反応を触媒するアルコール酸化酵素のみでなく、第1, 2段階目の反応を触媒する酵素の機能強化を行うことで生産性の向上を目指すこととした。その際に、目的の有機酸の産生にともなって、培養液中のpHが低下することに着目し、pH指示薬を添加した寒天プレート培地で、有機酸合成量が向上するとコロニー周辺の培地の色の変化でによって各高活性変異体を選抜できるアッセイ系を構築した。構築したアッセイ系を用いて、ランダム変異を導入した第1, 2段階目の反応を触媒する酵素遺伝子を共発現した組換え大腸菌を選抜した結果、グリコール酸産生量が検討前と比較して約1.5倍程度向上した大腸菌株を見出した。よって、第1, 2段階目の反応を触媒する酵素変異体の作成にも成功したと考えられる。現在、変異部位の特定と各酵素変異体の解析を試みている。
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