| 研究課題/領域番号 |
18K12056
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| 研究機関 | 京都大学 |
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研究代表者 |
平方 秀男 京都大学, 医学研究科, 客員研究員 (70271509)
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| 研究分担者 |
杉田 尚子 京都大学, 医学研究科, 特定病院助教 (20750532)
伊井 仁志 首都大学東京, システムデザイン研究科, 准教授 (50513016)
巽 和也 京都大学, 工学研究科, 准教授 (90372854)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | 静脈血栓塞栓症 / トロンビン / 数理モデル / 移流拡散 |
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| 研究実績の概要 |
静脈血栓塞栓症は発症予測が困難で高率に突然死する。現在のVTE発症予測は臨床的な危険因子を列挙するにとどまり有効性に疑問が残る。新鮮な静脈血栓の力学的性状が発症のカギをにぎるが、詳細は不明である。血栓形成・構造などは主要な凝固因子であるトロンビンの拡散・濃度分布や流れ方が重要と考えられる。そこで、様々な条件下でトロンビンを可視化して、血栓形成～成長・構造と対比して様々な条件が血栓構造などに与える影響を解明することとした。
まず我々は独自のマイクロ流路システムを自作して血流中で様々な条件設定（温度、血小板数、流速、ヘマトクリットなど）の下で「リアルタイムに血小板からフィブリンが発生・成長する様子」や「せん断速度やヘマトクリットと共にフィブリン繊維の配向性が増加すること」を明らかにした。
トロンビンを蛍光として測定する方法は数多く報告されているが、我々が持つ蛍光顕微鏡によりマイクロ流路内で流血中のトロンビンを可視化するのに適した方法を確立した。活性化した血小板膜表面上でトロンビンバーストが起こることは知られていたが従来は血小板凝集塊の一部の血小板のみでトロンビンバーストが起こるとれていた。しかし我々の可視化した方法では活性化した血小板のほとんどでトロンビンバーストが起こっており、そこを核にしてフィブリンの発生～成長が起こることを発見した。またこれらの変化をリアルタイムで可視化する方法論も確立した。この成果の発表を本年7月ミラノで開催される国際血栓止血学会で予定していたがCOVID-19の影響で学会そのものが中止となってしまった。
「トロンビンの拡散・分布・流れ」と「血栓形成・成長～構造」を同時にリアルタイムに捉えることで様々な条件と静脈血栓形成過程や血栓構造の関係を解明できると考えられる。トロンビンが流路内を血流にのって流れる様子をリアルタイムで観察する事にも成功した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
上述のごとく大半のステップ、たとえばトロンビンの可視化と血栓形成～成長を同時にリアルタイムでとらえるまでのステップ、などは順調に進行した。ただ、血流中でのトロンビンの「拡散・濃度分布・流れ」と血栓形成～成長の同時観察が遅れた。その理由は以下のとおりである。トロンビンの可視化試薬は紫外線で励起するが、あまり強い紫外線を照射すると血液そのものに影響が出る。そこで現システムでトロンビンの生成だけでなく「拡散・濃度分布・流れ」を可視化するためにはトロンビン可視化試薬をやや高濃度で使用する必要があったが、この高濃度の試薬が血栓形成～成長に影響を及ぼしたことが第一の理由である。さらに節電などの影響で実験室の室温が外気温に左右されることがあり血栓形成～成長に影響を及ぼしたことも関与している。実験室の室温問題はヒートブロックなどを追加使用することで、すでに解決した。試薬の濃度問題は間もなく高感度カメラを貸与してもらえる見込みができたので、速やかに解決可能と考える。このトロンビンの「拡散・濃度分布・流れ」と血栓形成～成長の同時観察問題を可及的速やかに解決し、各種条件設定下（ヘマトクリット、温度、せん断速度、血小板数など）における、活性化した血小板近傍の「トロンビンの拡散・濃度分布・流れ」と「血栓形成～成長・構造」を同時にリアルタイムで観察するというステップへ進展させることとする。
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| 今後の研究の推進方策 |
トロンビン「拡散・濃度分布・流れ」の可視化と血栓形成～成長を同時にリアルタイムでとらえることは、７で述べた高感度カメラの導入により間もなく可能になると考えている。そこで、トロンビン「拡散・濃度分布・流れ」と血栓形成～成長の同時リアルタイム観察をまず遂行する。
次に、この技術を応用して各種条件設定下（ヘマトクリット、温度、せん断速度、血小板数など）で活性化した血小板近傍の「トロンビンの拡散・濃度分布・流れ」と「血栓形成～成長・構造」を同時にリアルタイムで観察する。
このデータを用いて、以前作った血栓成長の移流拡散反応モデルを精密化することで様々な条件が「トロンビンの拡散・濃度分布・流れ」「血栓～成長・構造」に及ぼす影響を解明 する。
本研究は血栓の構造や発生・成長過程と様々な条件を数理モデル化することでVTE予測～予防～救命という医療への革新的な技術提供の第一歩とする。さらに、本研究で得られるデータは流体力学で未解明である赤血球などのかく乱因子がある場合の移流拡散問題の基礎データともなるので、巽（分担）が参画する移流拡散に関する国際研究グループにデータを提供し流体力学分野にも貢献する。
さらに血栓症が多いとされる“うつ病患者”を杉田（分担）がリクルートし臨床経過を観察すると共に患者血液の場合では拡散・分布や血栓形成が健常人と異なるか否かも明らかにする。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
前年度の作成した要素技術が極めて有効に働き、トロンビン「拡散・濃度分布・流れ」と血栓形成～成長の同時リアルタイム観察以外の部分は極めて順調に進行し、追加の工夫や試行錯誤がほとんどなかったことが大きな要因である。さらに問題のトロンビン「拡散・濃度分布・流れ」と血栓形成～成長の同時リアルタイム観察に関しても共同研究者（分担）の巽より高感度カメラを貸与していただける見込みがついたので、この問題の解決にも特段の費用が発生しなくなったことも大きな要因となった。さらに血小板やフィブリン網の可視化試薬の保存・輸送方法を改善することで試薬の使用できる期間が長くなっただけでなく、使用濃度も抑えることができた。マイクロ流路システムを作る際に使用する原型が予想以上に耐久性があり長持ちしたことで、原型を作り直すための費用が大いに節減できた。さらにマイクロ流路そのものも複数回使用できる方法を確立できたので、マイクロ流路作成にかかる費用も節減できた。温度管理システムも比較的小型のもので十分な管理ができるようになったことも経費節減に奏功した。
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