| 研究課題/領域番号 |
18K12077
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| 研究機関 | 京都大学 |
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研究代表者 |
澤田 晋一 京都大学, 工学研究科, 助教 (50444104)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | 自己組織化 / 核酸 / 刺激応答性 / ナノゲル / タンパク質 / シャペロン |
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| 研究実績の概要 |
本研究の目的である、申請者がこれまでに研究を進めてきたオリゴ核酸修飾多糖ナノゲル（核酸クリップナノゲル）のさらなる機能化と生体高分子の中でも特にタンパク質との相互作用について基礎的な知見を得るとともに、タンパク質の構造、機能を制御し得る核酸クリップナノゲルの構築を進める。平成30年度は、タンパク質との相互作用に適したオリゴ核酸修飾多糖の設計と合成およびその基礎特性解析を行った。これまでに開発してきた核酸クリップナノゲルでは会合分子であるオリゴ核酸の構造に自己相補的配列（回文配列）を用いて来たが、タンパク質と核酸クリップナノゲルの相互作用により適したオリゴ核酸として非自己相補的配列のオリゴ核酸を会合分子として用いたオリゴ核酸修飾多糖を合成した。グアニンおよびシトシンにBNAを用い、種々の配列の6merオリゴ核酸を固相合成法により合成した後、それらをプルランに導入することでオリゴ核酸修飾プルランを得た。相補的な配列を有するオリゴ核酸修飾プルラン溶液同士を混合した後、超音波処理を行うことでオリゴ核酸の二重鎖形成による会合体形成を検討したところ、動的光散乱測定より50-100nm程度の微粒子を形成していることが確認された。また、電子顕微鏡（TEM）により観察した結果、動的光散乱測定で得られた粒径と同程度の直径を有した微粒子状構造が確認された。得られた会合体微粒子（核酸クリップナノゲル）はサイズ排除クロマトグラフィー多角度光散乱測定から数十分子のオリゴ核酸修飾プルランにより形成していることが確認された。次に、この核酸クリップナノゲルとモデル分子である相補的配列を有する蛍光修飾オリゴ核酸の相互作用を検討したところ、低温で混合静置することでナノゲルとオリゴ核酸を複合化し得ることが確認され、タンパク質との相互作用を検討する上で必要なオリゴ核酸修飾多糖ナノゲル設計の知見を得ることができた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
平成30年度は、当初、これまでに開発してきた自己相補的配列（回文配列）オリゴ核酸を修飾したオリゴ核酸修飾プルランから成る核酸クリップナノゲルとタンパク質との相互作用について検討を行う予定であったが、ナノゲル形成に高温過程を経るアニーリング処理が必要なことや、分子内自己会合によるユニマーナノゲルを形成し得ることがタンパク質との相互作用を検討する上で障害となることが懸念されたため、次年度以降で計画していた会合点となるオリゴ核酸の配列設計を前倒して進めることとした。その結果、非自己相補的配列で鎖長として6merであり、配列中に人工核酸であるBNAを2-4個置換したオリゴ核酸を会合性分子として用いることで、相補的配列のオリゴ核酸を修飾した２種類のオリゴ核酸修飾プルラン溶液を混合し超音波処理するだけでナノゲルを形成し得ることが確認され、タンパク質との相互作用検討に適した核酸クリップナノゲル設計指針を得ることができた。また、オリゴ核酸の合成およびその多糖への導入についてもより効率化をはかることが出来、結果として今後生じるであろう課題を予め解決することが出来た。得られたオリゴ核酸修飾多糖の物性解析も進めており、相対的な研究計画自体の進行度合いとしては概ね順調である。
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| 今後の研究の推進方策 |
2019年度からは平成30年度に開発した核酸クリップナノゲルとタンパク質との相互作用について検討を行う。モデルタンパク質としては等電点の異なるタンパク質および酵素を選択して評価する。核酸クリップナノゲルとタンパク質との相互作用の検討においてはタンパク質の構造変化にも着目し解析を行う。相互作用の検討は、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）、電気泳動法、蛍光相関分光解析装置（FCS）、円二色性分散計（CD）等を用いて行う。また、温度変化条件での核酸クリップナノゲルとタンパク質の相互作用についても検討を行い、温度応答性微粒子としての機能についても評価する。核酸クリップナノゲルとの相互作用とタンパク質機能との相関についても酵素をモデルタンパク質としてその酵素活性を指標として核酸クリップナノゲルのシャペロン機能を評価する。同時にタンパク質とナノゲルとの相互作用を増強する分子設計として、タンパク質へのオリゴ核酸の導入の検討も行う。温和な条件でのタンパク質へのオリゴ核酸修飾条件やオリゴ核酸側の分子設計を進め、オリゴ核酸の配列特異的な相互作用を介した核酸クリップナノゲルとタンパク質の複合体形成と機能解析も進めてゆく予定である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
予定していたバイオ試薬類の購入が研究の進捗状況に伴い予定していた実験を変更したため、それに相当する額が次年度使用額として生じた。次年度の実験計画に伴い、本来購入予定であったバイオ試薬類を購入する予定であり、次年度使用額をそれに当てる。
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