| 研究課題/領域番号 |
18K12081
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| 研究機関 | 長崎大学 |
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研究代表者 |
麓 伸太郎 長崎大学, 医歯薬学総合研究科(薬学系), 准教授 (70380988)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | 遺伝子・核酸工学材料 / 遺伝子導入法 / 遺伝子導入機構 / 組織中空間分布 / ナノ粒子 |
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| 研究実績の概要 |
本研究では、新規遺伝子導入ベクターとしてプラスミドDNA搭載脂質・炭酸カルシウムハイブリッドナノ粒子を設計している。この粒子は、エンドソーム酸性下炭酸カルシウムが崩壊し、効率的にプラスミドDNAを細胞質に放出するようにデザインされている。
まず、プラスミドDNAをエタノール相に分散する技術を開発し、エタノール相に塩化カルシウムと脂質、プラスミドDNAを分散し、水相にPEG修飾脂質と炭酸ナトリウムを溶解した後、これら２液を混合することで、ワンステップの操作によりナノ粒子を得ることに成功し、ヒト肝癌細胞株HepG2において市販の遺伝子導入試薬であるLipofectamine3000（LFN3000）と同等の高い導入効率を示すことが明らかになった。このような複雑なナノ粒子を簡便に再現良く調製できるようになったが、粒子径が200 nm程度と大きく、標的である癌への送達効率に問題があることが想定された。脂質濃度、カチオン性脂質・中性脂質比、塩濃度など因子数が多く、総当たりで実験を行った場合、8748条件となり、全て実験を行うのは現実的ではない。そこで2020年度は、ナノ粒子の調製条件の最適化を行うにあたり、実験計画法を用いることとした。決定的スクリーニングに従い、26条件で実験を行ったところ、粒子径についてはPEG脂質濃度、PDIについてはエタノール相、水相の容量比、ゼータ電位については炭酸カルシウム濃度がスクリーニングされた。遺伝子発現に関しては炭酸カルシウム濃度が２乗項として、細胞毒性についてはPEG脂質が影響を与えた。至適条件において、充分に高い遺伝子発現効率を示しつつ、粒子径を120 nm程度まで縮小することに成功した。
試験管レベルの最適化はほぼ終わったと考えている。従って、最終年度には動物実験を行っていきたい。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
実験計画法により、充分に小さな粒子径で高い遺伝子発現効率を示す条件を見出した。また、前年度までに組織透明化による組織中空間分布評価系を確立している。従って、最終年度に動物実験により遺伝子発現効率、組織中空間分布評価を行える目途が立ったものと考える。
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| 今後の研究の推進方策 |
依然コロナウイルスの影響はあるものの、実験動物（マウス）を用いた評価を行う。
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