| 研究課題/領域番号 |
18K12087
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| 研究機関 | 関西大学 |
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研究代表者 |
柿木 佐知朗 関西大学, 化学生命工学部, 准教授 (70421419)
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| 研究分担者 |
伊井 正明 大阪医科大学, 研究支援センター, 講師 (10442922)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | ポリテトラフルオロエチレン / ペプチド固定化 / リガンドペプチド / チロシン酸化 / マイケル付加反応 / 安定化 / 表面解析 / 血小板粘着性 |
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| 研究実績の概要 |
2018年度は、研究計画調書に記載の（１）およびに（２）の一部について検討し、以下の成果を得た。
（１）ペプチド固定化効率の高いチロシンアンカー配列の設計
チロシンアンカー配列にリジン残基もしくはグルタミン酸残基を導入したフィブロネクチン由来ペプチド、Ac-(Tyr-Lys)3-Gly3-Leu-Asp-Val (YK3)およびAc-(Tyr-Glu)3-Gly3-Leu-Asp-Val (YE3)を汎用のFmoc固相法で合成し、高純度の両ペプチドを得た。ePTFEフィルムを各ペプチド水溶液に浸漬させ、触媒/酸化剤を添加して50℃で24時間反応後、充分に水洗して試料表面を解析した。その結果、YK3（触媒/酸化剤添加）が他の群と比較して優位に水接触角が減少し、かつXPSでのペプチド由来窒素も強く検出された。さらに、この方法でePTFEフィルム上に固定化されたYK3は、高濃度のSDS水溶液もしくは塩化ナトリウム水溶液で洗浄しても保持されていたことから、チロシン残基とリジン残基間がマイケル付加反応によって架橋構造を形成することで安定な疑似自己組織化層を形成したことが示唆された。
（２）ペプチド固定化ePTFE基材上への細胞・血小板接着性の評価
YK3を固定化したePTFEフィルム上にヒト血小板（健康なドナーから提供された全血より多血小板血漿を調製・倫理委員会の承認を得て実施）した。その結果、未修飾とほぼ同様に、YK3を固定化したePTFEフィルム上には血小板は粘着しなかった。血小板はカチオン性表面には粘着する傾向があることを踏まえると、YK3分子中のリジン残基はチロシン残基と反応し、血小板の粘着を引き起こすほどの未反応遊離アミノ基が残存していないことが示唆された。引き続き、YK3固定化ePTFEフィルム上への血管内皮細胞や間葉系幹細胞の接着性を評価し、LDVリガンド固定化効果を検証する。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本研究課題は３か年の計画で、研究代表者らが開発したチロシン残基の酸化反応によるePTFEへのペプチドリガンドの安定な直接固定化とその人工血管への有用性の検証を目的としている。
2018年度に、高純度のYE3およびYK3ペプチドの合成、ePTFEフィルム表面へのペプチドの固定化、さらに固定化されたYK3の優れた安定性を示すことができた。YK3でのみePTFEフィルム表面に安定に固定化されたことから、チロシン残基の酸化によって生じるキノンがリジン残基とマイケル付加反応することで架橋構造を形成することで固定化されたYK3の安定性がチロシン残基のみをアンカーとする場合よりも飛躍的に向上したと予想される。これらは、我々が考案したアンカー配列の有用性を示唆する大きな成果である。
さらに、当初2019年度に予定していたヒト血小板粘着性試験にも着手し、YK3を固定化したePTFEフィルムにはヒト血小板がほとんど粘着しないことも明らかとした。
以上の進捗を考慮し、本研究課題は当初の計画の通り順調に進捗していると判断した。
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| 今後の研究の推進方策 |
今後は、当初の研究計画に準じて、ePTFEフィルム上に固定化されたLDVリガンドの特異的な生理機能を立証するために血管内皮細胞や間葉系幹細胞の接着性を評価する。既にヒト臍帯静脈由来血管内皮細胞を用いた予備実験に着手しており、YK3を固定化したePTFEフィルム上に同細胞が接着する傾向が見られている。引き続き評価を進めて、その統計学的な有意差を検証し、YK3固定化効果を立証したい。さらに、マウスからの脂肪由来間葉系細胞の採取や培養手技を確立し、YK3固定化ePTFEフィルム上での接着や増殖についても評価する。さらに、最終年度のin vivo評価に向けて、人工血管を見立てたePTFEチューブの選定や移植術式の確認など、YK3固定化ePTFEのラットへの移植モデルの作製にも着手する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
当初計上していた学会参加を別の研究費（別課題の成果報告も兼ねていたため）で支出するなど、旅費の総支出が予定よりも少額になったため繰り越しが生じた。これらは次年度計画予算の消耗品費に充填し、旅費およびその他経費は変更する予定はない。
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