| 研究課題/領域番号 |
18K12574
|
|---|
| 研究機関 | 山口大学 |
|---|
研究代表者 |
小室 隆 山口大学, 大学院創成科学研究科, 助教(特命) (40782561)
|
|---|
| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
|
| キーワード | 湖沼堆積物 / 環境DNA / 車軸藻類 |
|---|
| 研究実績の概要 |
本研究は宍道湖の湖沼堆積物から，水生植物のDNAを抽出することで過去からの水生植物,なかでもかつて宍道湖における優占種であったと考えられる車軸藻類の変遷を明らかにする．
平成30年度の研究目標は，1)堆積物からのDNA抽出可能の検討，2)年代の特定である．なお当初の予定1),2)に加え，船上での堆積物の保存および抽出方法の検討を加えた．堆積物からの環境DNA抽出においては，水からの抽出に比べコンタミネーションによる危険性が高いため，細心の注意を払い，柱状堆積物の切断および，DNAを抽出するまでの保存方法が重要になる．そのため，平成30年度は令和元年に向けて，採取および抽出方法の検討を主として行った．
船上からKK式簡易採泥器を用い約40cmの柱状堆積物を採取した後，船上で2cmに切断し，抽出を行うまで90%エタノールの入った容器に入れ冷蔵保存した．抽出に用いた堆積物はコンタミネーションの影響を最小限にするため，切断した堆積物の中心部のみを抽出に使用した．また，船上で堆積物を切断する際は，採泥に使用した採泥器と同じ内径のアクリルパイプを2cmごとに切断したものを使用した．
DNA抽出は①エタノール沈殿法と，②市販の土壌からのDNA抽出キットを使用した2通りの方法で行った．①エタノール沈殿法は大量の堆積物を扱うためコストを最小限に抑えられる利点があるが，抽出を行ったところ，堆積物中に存在する阻害物質（例えばフミン酸）などにより十分な収量を得ることができないことが分かった．そこで，②市販されている土壌からDNA抽出キットを使用して抽出を行ったところ，十分な収量を得ることに成功した．その後②の方法により抽出したDNAはリアルタイムPCR法により増幅させ，シャジクモのプライマーを用いて検出を行った．しかし，目標としていたシャジクモ属のDNAをシーケンスにより確認することができなかった．
|
| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
抽出方法により，収量が大きく差が出ることが分かり，②市販の土壌からのDNA抽出キットを使用することで十分な収量を得ることができたが，対象とするシャジクモのDNAを検出することができなかった．これは最終地点の見直し，ターゲットとする種を増やす，プライマーを複数種分用意することで解決できる可能性がある．
|
| 今後の研究の推進方策 |
採泥地点を2地点で行ったが宍道湖全域（水深の浅い地点も含む）からの堆積物採取し，過去に生息していた車軸藻類，Chara braunii, C.corallina, C. fibrosa, Nitella. hyalinaのプライマーを用いてPCRおよび，シーケンスを行う．得られた結果から，対象種が検出された地点の堆積物から年代を測定し，年代を決定する．
|
| 次年度使用額が生じた理由 |
備品を見積もりよりも少額で購入することができたため，次年度使用額が生じた．次年度は複数地点からDNA抽出を行うため，抽出試薬代に充当する予定である．
|
