| 研究課題/領域番号 |
18K13036
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| 研究機関 | 岩手医科大学 |
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研究代表者 |
吉田 潤 岩手医科大学, 教養教育センター, 助教 (20611007)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | Falcarindiol / 機能性物質 / GSK-3β / インスリン / 糖新生 / セリ科植物 / ウコギ科植物 / ポリアセチレン化合物 |
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| 研究実績の概要 |
本研究は、高濃度カルシウムを含む培地で培養すると生育不全になる遺伝子変異酵母株に対して生育回復を誘導する物質を食材から探索し、新たな機能性物質として開発する研究である。特に、セリ科の食材やウコギ科の山菜に含まれるポリアセチレン化合物の新たな機能性の開拓研究として、糖代謝改善効果に関わる糖新生抑制作用の作用機序を明らかにすることを目的としている。今年度は主に、セリ科の野菜や山菜のウドから単離精製した活性物質のfalcarindiolのインスリンシグナル伝達経路に関わる作用の解析と、セリ科の食材やウコギ科の山菜に含まれる構造類縁体の機能性評価を行った。
昨年度までにfalcarindiolの作用による肝臓がん由来細胞株H4IIEにおけるグルコース産生抑制作用の作用メカニズムとして、GSK-3βのリン酸化亢進に伴う不活性化の関与が示唆されたが、糖新生律速酵素の遺伝子発現に関わるフォークヘッド型転写因子FOXOファミリーの不活性化が関与するのかが明らかでなかった。Falcarindiolの作用によりFoxO1タンパク質量発現量が減少する兆候がみられたことから、GSK-3βの不活性化を介したタンパク質発現系または分解系に影響がある可能性が得られた。
一方、これまでの検討から肝細胞で糖新生活性化時のグルコース産生が抑制される作用を見出したが、構造類縁体のポリアセチレン化合物の生物活性は不明であった。そこでセリ科の食材やウコギ科の山菜に含まれるポリアセチレン化合物の生物活性を検討した結果、同程度の濃度で肝細胞の糖新生を抑制する構造類縁体を見出した。これらの結果から食材ポリアセチレン化合物を豊富に含有するセリ科やウコギ科の食材を食品機能性素材や薬用植物資源として有効利用できる可能性が得られた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
Falcarindiolの糖新生抑制作用の作用機構の解析に関しては、主にラット肝臓がん由来細胞株H4IIEにおけるインスリンシグナル伝達経路の下流に対する影響の有無について検討し、ウコギ科山菜に含まれる構造類縁体の有無の検討については、ウドやヤマウコギを中心に実施する計画であった。前者については、これまでにインスリンシグナル伝達の上流にあるAktのリン酸化による活性化に対して影響しないことが示唆されており、一方でAktの直接の基質であるGSK-3βのリン酸化による不活性化を誘導する現象が認められている。このことから、falcarindiolはインスリンシグナル伝達経路のAktよりも下流の分子に作用することで糖新生律速酵素の遺伝子発現に影響を与えてグルコース産生を抑制している可能性が考えられた。そこでfalcarindiolを作用させたときの糖新生律速酵素群の転写因子化への影響を解析したところ、インスリン刺激では短時間ではFoxO1のリン酸化、長時間ではFoxO1のタンパク質発現量の減少がみられたの対し、falcarindiol刺激ではFoxO1のリン酸化の増加に変化がみられなかったが短時間でFoxO1のタンパク質発現量が減少する兆候がみられた。以上から、falcarindiolの作用はインスリンによる作用機序とは異なることを明らかにすることができ、当初の研究計画に準じた結果を得ることができた。一方、後者についてもウドに含まれるfalcarindiolの構造類縁体であるfalcarinolのGSK-3β阻害活性とグルコース産生抑制作用を解析した結果、falcarinolはfalcarindiolと同程度の阻害活性を示す知見を得ることができたことから期待する結果の一部を得たと言える。
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| 今後の研究の推進方策 |
1. Falcarindiolの糖新生抑制効果における作用機序の解析
インスリンシグナル伝達に対する作用はFoxOファミリーへの作用が重要と考えられるため引続きFoxO1のタンパク質発現量への影響に対する機構解明を遂行する。リン酸化によるAktの活性化を介さずにリン酸化によるGSK-3βの不活性化が誘導される現象の作用機構について不明な点が残されているが、市販のGSK-3β阻害剤も同様の現象がみられることから、直接的な阻害による結果と予想される。そのため、まだ途上にあるGSK-3βの不活性化機構を中心に解析することで糖新生抑制作用の作用機序の解析に繋がると考えられる。
2. タンパク質合成・オートファジー機構におけるfalcarindiolの活性評価とその機序の解析
細胞レベルでの作用機序の解析については、falcarindiolでH4IIE細胞を刺激した際にmTOR経路のリン酸化が認められ、ラパマイシンで作用が消失したことから、falcarindiolはmTOR経路の活性化に寄与すると想定される。そこでmTOR経路の活性化状況およびその活性調節タンパク質群のリン酸化状態を検証していく。さらにタンパク質分解系として、オートファジーやユビキチン系の関与などのメカニズム解析が不十分であることから、その点を詳細に検討する。
3. ウコギ科山菜に含まれるポリアセチレン化合物の有効性評価と活性物質の同定
各種ウコギ科山菜の活性評価に関しては、メタノール抽出物に加えてヘキサン抽出物を調製してカルシウム感受性の遺伝子変異酵母株YNS17に対する生育回復活性を検証する。より高活性のポリアセチレン化合物の存在が示唆された場合は糖新生抑制効果などの各種機能性を評価していく。さらに活性物質を単離精製して構造を同定し、GSK-3β阻害活性及び各種細胞試験にて抗2型糖尿病作用を評価していく。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
本研究課題を遂行する過程で、想定していた結果と共にタンパク質分解系に関わる興味深い結果が得られたことから、この結果に対する検証実験を行う必要がある。そのためのヒト肝細胞試験における検証実験を継続するため次年度使用額が生じた。また、乾燥したウドやヤマウコギをメタノールまたはヘキサン抽出し、カラムクロマトグラフィーとHPLCにて単離精製し、MSによる質量分析とNMRのスペクトル解析にて構造を確認する。セイタカアワダチソウなどポリアセチレン化合物を含有する植物抽出物を調製して酵素阻害活性を測定する。Falcarindiol類を作用させたヒト肝がん細胞の細胞溶解液を調製し、グリコーゲンアッセイキットとリピットアッセイキットを用いて細胞内のグリコーゲンと脂肪球を定量する。
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