| 研究実績の概要 |
最終年度は核小体低分子RNA（snoRNA）のシュードウリジン化修飾を解析した。ヒトリンパ芽球TK6細胞のウリジン一リン酸合成酵素 (UMPS) 遺伝子がノックアウトされた、ΔUMPS株に5,6-d2ラベルウリジンを処理培養し、得られたトータルRNAからU3 snoRNAを精製した。この細胞株は培地中のウリジンを取込み、RNAを合成するサルベージ経路のみが進行する。5,6-d2ラベルウリジンを細胞培養液に添加し培養することで、ウリジンに比べて重水素2個分 (2Da) だけ質量が増加したトータル RNAが得られた。次にエタノール沈殿法を用いてラージRNAとスモール RNAに分け、スモール RNA画分をUrea PAGEで分画し、目的のU3 snoRNAを取得した。U3 snoRNAは逆相液体クロマトグラフィーで精製した後、RNase T1またはRNase Aで消化し、LC-MSで分析した。ウリジンがシュードウリジン化されると質量が1Da減少することから、予め計算しておいた精密質量と実測値を比較することで、修飾サイトを同定した。これまで、シュードMS3法でシュードウリジンを含む可能性があるがその場所が不明瞭であったヒトU3 snoRNAについて解析した結果、Ψ8、Ψ12、Ψ36、Ψ49の新規シュードウリジン化修飾が明らかになった。そこでU3発現ベクターを作製し、 SILNAS 法を用いて、本研究で見出した新規シュードウリジン化サイトが擬陽性でないことを検証した。
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