| 研究実績の概要 |
これまでに、表面プラズモン共鳴（SPR）のセンサー基板上へDNAを効率的に固定化するために、片側にナイトロジェンマスタードを持ち、もう片側に環状ジスルフィドを有するリンカー分子L1を使用してきた。しかし、L1を使用した実験系では抗体がセンサー基板へ非特異吸着することがわかり、複数のシトシンバリアント計測に適さないと考えた。そこで、環状ジスルフィドをビオチンに置換した新規リンカー分子L2を新たに開発した。異なるL2濃度で修飾したオリゴDNAをSPRにて評価したところ、センサー基板上でDNAが十分に固定化され、かつ抗体の非特異吸着がほとんど生じないことを確認した。さらに、4種のシトシンバリアント（5-メチルシトシン, 5mC; 5-ヒドロキシメチルシトシン, 5hmC; 5-ホルミルシトシン, 5fC; 5-カルボキシルシトシン, 5caC）をそれぞれ有するオリゴDNAを固定化し、各種抗体を送液したところ、それぞれの抗体によってシトシンバリアントを選択的に識別することに成功した。また、次年度実施予定の細胞のゲノムDNAのシトシンバリアント率評価の予備検討として、4種のシトシンバリアントを含有するゲノムDNAをin vitroで調製した。具体的には、非メチル化λDNAをCpGメチラーゼによって5mCを導入し、さらにTET1によって5mCを5hmC/5fC/5caCに変換した。調製したλDNAをSPRで評価した結果、ゲノムDNAのシトシンバリアントを一括で評価することに成功した。
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