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本申請研究では、リン光色素を利用した細胞外および細胞内の過酸化水素プローブを開発し、最終的にはこれらの過酸化水素プローブの細胞実験への利用を目指す。
過酸化水素は、生体分子に酸化障害を与えるだけでなく、生命活動に不可欠なシグナル伝達物質として近年注目されている。そこで、顕微鏡観察に用いる様々な過酸化水素プローブが開発されているが、細胞内外の過酸化水素濃度変化をライブイメージングできるものはこれまでにない。
令和元年度は、細胞内過酸化水素プローブとして、リン光色素を修飾したカタラーゼを調製した。リン光色素である白金ポルフィリンPtTCPPを用いて、PtTCPPの末端カルボン酸をカタラーゼ表面のアミノ基に結合させた。さらに、生体適合性向上のためポリエチレングリコールを修飾したカタラーゼにも同様にPtTCPPを修飾させた。リン光色素を修飾したこれらのカタラーゼをカラムクロマトグラフで精製し、細胞内過酸化水素プローブとした。
さらに、前年度調製した細胞外過酸化水素プロープを応用して、固定化する酵素をグルコースオキシダーゼにしたグルコースプロープを新たに開発した。細胞外過酸化水素プロープと同じリン光色素含有ビーズの表面ににpoly-L-リシンを化学修飾させ、グルコースオキシダーゼを静電的相互作用で固定化した。本申請研究にて購入した蛍光顕微鏡を用いて、調製したグルコースオキシダーゼ固定化ビーズを含む溶液のグルコース濃度を変化させることで、それに応じたリン光強度変化を観察できた。このように、本研究で開発したプローブは用いる酵素を変えることで様々な低分子の濃度を観察できると言える。
以上の実験結果から、リン光色素を利用した細胞外および細胞内過酸化水素およびグルコースプローブの開発を達成した。
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