腸内細菌が有する酵素特異的な専用シャペロンによるフォールディングメカニズムの解明

2019 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 18K14388
• 研究機関: 東京大学
• 研究代表者: 山田 千早 東京大学, 大学院農学生命科学研究科(農学部), 助教 (30747944)
• 研究期間 (年度): 2018-04-01 – 2021-03-31
• キーワード: シャペロン / フォールディング / 腸内細菌

研究実績の概要

近年、母乳オリゴ糖分解酵素（LnbX）に対して特異的に作用するシャペロン（LnbY）が発見されたが、相同配列が他のシャペロンに限らず見つからないため機能を推測することができていない。そこで本研究課題では、LnbXの下流に存在し菌体外で働くと推測される専用シャペロンLnbYによるフォールディング作用機構を明らかにすることを目的とする。
共同研究者のグループが新規なLnbXホモログを発見し、それらも活性型の構造をとる際にシャペロンを必要とすることがわかった。ほとんどのホモログはシャペロン様配列が別のORFに存在していたが、それとは全く異なり、LnbXホモログのN末側にシャペロン様配列が存在していた。構造解析を行ったところ、1.4Åの分解能でLNBとの複合体構造が得られた。LnbXホモログのドメインはLnbXと同じβヘリックス構造をしていた。シャペロン様ドメインは８本のαヘリックスからなり、これまでに報告のない新規な構造をしていた。もっとも類似している構造は、Helicobacter pylori由来のPPIaseであったが、類似していたのは一部分のみだった。LnbYの結晶構造解析には現段階で成功していないが、ホモログのシャペロン様構造を明らかにした。LnbYとの相同性は22%と低く、今後、構造を明らかにしたシャペロンがLnbXに働くかどうか特異性を調べる予定である。本研究成果はNature communicationsに掲載される。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

Eubacterium ramulusから新規なLnbXホモログが見つかり、N末端にシャペロンとして働いていると推測される配列が存在していた。その結晶構造を解析し、位相はSe-Met置換体を用いて決定した。N末に存在するシャペロン様ドメイン構造は８本のαヘリックスからなり、これまでに報告のない新規な構造をしていた。もっとも類似しているとされるのはPPIaseであったが、６番目と７番目のαヘリックスのみ類似していた。Y145が活性中心付近に存在しており、変異体Y145Aでは基質ラクト-N-テトラオースに対するKmが５倍上昇した。本研究成果はNature communicationsに掲載される。

今後の研究の推進方策

１）LnbYの局在を調べる：ビフィズス菌の菌体外に存在しているか確認 LnbYの抗体を用いてウエスタンブロッティングを行う。ビフィズス菌の細胞を短時間プロテアーゼ処理することで分解された場合、菌体表面に局在していることが示される。
２）LnbYの構造解析およびシャペロン不要なLnbX構造への改変 LnbYの構造解析の実現が困難と判断されるため、SAXS（X線小角散乱）を行い溶液中のLnbYの構造および変性LnbXと結合したLnbX-Y複合体の状態を観察する。同様に、項目３で明らかにしたLnbY以外のシャペロンについても構造解析を行う。
３）類似シャペロンの探索および基質特異性の解析 大腸菌への共発現系を用いた方法および無細胞in vitroタンパク質発現系をそれぞれ用いて、LnbYを含むそれぞれのシャペロンの特異性を明らかにする。

次年度使用額が生じた理由

産前産後休暇及び認可保育園に入園できなかったため予定にはなかった育児休暇の延長をしなければならなくなり1年弱研究活動をすることがでず、使用することができなかったため次年度に繰り越した。次年度では、LnbYの局在を調べるためにウェスタンブロッティングを行うための試薬および抗体を発注するために使用する。また、シャペロンの特異性を調べるためにクローニングやタンパク質発現・精製、活性を調べるための試薬を購入する。

研究成果

• [国際共同研究] Technical University of Denmark(デンマーク)
  • 国名: デンマーク
  • 外国機関名: Technical University of Denmark
• [雑誌論文] Butyrate producing Clostridiales utilize distinct human milk oligosaccharides correlating to early colonization and prevalence in the human gut (2020)
  • 著者名/発表者名: Michael Jakob Pichler, Chihaya Yamada, Bashar Shuoker, Maria Camila Alvarez-Silva, Aina Gotoh, Maria Louise Leth, Erwin Schoof, Toshihiko Katoh, Mikiyasu Sakanaka, Takane Katayama, Chunsheng Jin, Niclas G. Karlsson, Manimozhiyan Arumugam, Shinya Fushinobu, Maher Abou Hachem
  • 雑誌名: Nature communications 巻: － ページ: －
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著