| 研究課題/領域番号 |
18K14394
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| 研究機関 | 立命館大学 |
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研究代表者 |
林 順司 立命館大学, 生命科学部, 助教 (20802101)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | 酵素工学 / 酵素 / 超好熱菌 / 構造生物学 |
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| 研究実績の概要 |
本研究の目的は、立体構造情報を基にバイオセンサー素子として最適な色素依存性D-乳酸脱水素酵素（Dye-DLDH）を開発することである。本研究はD-乳酸の新規測定法開発において重要な役割を果たすと考えられる。
超好熱菌・好熱菌のゲノム情報に基づき機能が特定されていないDye-DLDHホモログの検索を行った結果、10種類以上のDye-DLDHの存在を推定している。当該年度では、超好熱菌Pyrobaculum aerophilumとPyrobaculum calidifontisに見出した計4種のホモログに関して、大腸菌における発現系構築を行った。その結果、P. aerophilumのホモログPAE2035のみ可溶性画分に発現が認められた。活性染色法による触媒活性の同定の結果、本発現産物からDye-DLDH活性が得られた。各種クロマトグラフィーによる精製を行い、本酵素を電気泳動的にほぼ単一に精製することに成功した。精製酵素を用いた酵素化学的特徴づけの結果、本酵素は90℃、10分間の熱処理でも失活しない高い熱安定性を有しており、既報のDye-DLDHと比較して最も高い熱安定性を示すことが判明した。
今後は、本酵素のX線結晶構造解析および詳細な酵素化学的諸性質の解明を行うことで、バイオセンサー素子としての有用性を評価していく。
さらに、発現に成功しなかったホモログに関しても発現系を再検討する。最終的に複数の酵素を比較することで、バイオセンサー素子として優れた酵素を選抜する。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本年度の研究計画に掲げた目標である、超好熱菌から見出したDye-DLDHホモログに関して大腸菌によるタンパク質の発現系の構築に成功し、超好熱菌P. aerophilum由来Dye-DLDHを得ることに成功した。また、当該酵素に関して基本的な機能解析に成功したため、本年度の研究目的はほぼ達成できたと考えている。
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| 今後の研究の推進方策 |
次年度はP. aerophilum由来Dye-DLDHの詳細な機能解析（基質特異性、電子受容体特異性など）の解析を進める。また、本酵素の立体構造を明らかにするためにタンパク質の結晶化条件の検討も進めていく予定である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
初年度設備備品として紫外可視分光光度計の購入費として700000円を予定していたが、前年度までに購入できたことから本費用が生じなかった。一方で遺伝子実験系の試薬・器具類の消耗（計234036円）、タンパク質実験系器具類の消耗（計212868円）が多く、また実体顕微鏡の故障による新規購入の必要性（220158円）が生じた点から、結果として17020円が次年度使用額として生じた。次年度の交付予定が1000000円であるため、合計1017020円となる。次年度の費用内訳として、遺伝子組換え用試薬、酵素活性測定用試薬、タンパク質結晶化用試薬、タンパク質結晶化用試薬、および消耗品として867020円、出張旅費150000円を予定している。
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