| 研究課題/領域番号 |
18K14415
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| 研究機関 | 地方独立行政法人 大阪健康安全基盤研究所 |
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研究代表者 |
村上 太郎 地方独立行政法人 大阪健康安全基盤研究所, 衛生化学部, 主任研究員 (70393254)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | 小麦グリアジン / 人工消化液 / LC-QTOF/MS / プロアントシアニジン / モノクローナル抗体 / 反応阻害曲線 |
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| 研究実績の概要 |
前年度、人工消化液に小麦グリアジンペプチドを添加してLC-QTOF/MSによって測定を行ったところ、ペプチドフラグメントの検出ができなかった。消化液由来の夾雑成分による測定阻害が起こっていると考えられたため、今年度は人工消化液からの小麦グリアジンペプチドの抽出条件について検討を行った。夾雑成分から小麦グリアジンペプチドの回収率を上げるために、抽出液中のタンパク質変性剤や抽出液の精製法について検討した。タンパク質変性剤として塩化グアニジニウムを加えて抽出し、イオン交換基を導入したポリマー固相抽出カラムで精製することにより、人工消化液中の小麦グリアジンペプチドがLC-QTOF/MSによって検出可能となった。
グリアジン中のT細胞の応答に関与するペプチドを特異的に認識するモノクローナル抗体 (G12 mAb)を利用して、直接ELISA法によるスクリーニング条件を構築した。直接ELISA法による発色条件を最適化した結果、マイクロプレートの各wellに100 ng のグリアジンを固相化し、G12 mAbを1/64000希釈した際に良好な結果が得られた。次に、果実や種実などの食品からグリアジンのエピトープとの結合に関与する、プロアントシアニジン (PAC：Proanthocyanidin)を解析した。各試料抽出液に含まれるPACの反応阻害曲線を求めた。試料ごとのIC50は差異が確認された。PAC はEpicatechinなどのflavan-3-olを基本骨格とする重合体であるため、各試料に含まれるPACの基本骨格や重合度などが異なると考えられる。今後は、結合に寄与する構造や重合度などの要因について解析していく必要がある。
人工消化液によって消化を行った小麦グリアジンについて、培養細胞を使った腸管吸収モデルによる評価を行った際に、人工消化液中の消化酵素や胆汁酸などの成分によって培養細胞の生育阻害が確認された。このため、人工消化液によって処理を行った小麦グリアジンの評価するためには条件を検討する必要がある。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
今年度は人工消化液に小麦グリアジンペプチドのLC-QTOF/MSによる検出法の検討を行った。また、モノクローナル抗体 (G12 mAb)を利用して小麦グリアジン由来のペプチドに結合するPACのスクリーニング系を構築した。
人工消化液によって消化を行った小麦グリアジンについて、培養細胞を使った腸管吸収モデルによる評価を行った際に、人工消化液中の消化酵素や胆汁酸などの成分によって培養細胞の生育阻害が確認された。このため、人工消化液によって処理を行った小麦グリアジンの評価を行うために条件を再検討する必要が生じたため、研究の進歩に若干の遅れが生じている。必要に応じて、合成した小麦グリアジン由来ペプチドを利用した消化吸収についての評価法についても検討する。
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| 今後の研究の推進方策 |
植物種ごとにPACの小麦グリアジン由来ペプチドへの結合能の差異が確認されたため、得られた結果を元に次年度以降は培養細胞を使った腸管吸収モデルによって、PACが共存した状態で小麦グリアジンが消化吸収によって受ける影響を評価する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
培養細胞を使った腸管吸収モデルによる評価について条件を検討する必要が生じたため、次年度使用額が生じた。2019年度に生じた未使用の物品費については、2020年度の培養細胞を使った腸管吸収モデルについての物品費として使用する予定である。
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