| 研究課題/領域番号 |
18K14431
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| 研究機関 | 国立研究開発法人医薬基盤・健康・栄養研究所 |
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研究代表者 |
鈴木 一平 国立研究開発法人医薬基盤・健康・栄養研究所, 国立健康・栄養研究所 食品保健機能研究部, 研究員 (00812439)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | ビタミンB12 / リボヌクレオチドリダクターゼ / 酵素学的定量法 / 分析法の開発 / 乳酸菌 |
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| 研究実績の概要 |
ビタミンB12 (VB12) の微生物学的定量法に用いられる乳酸菌である、Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis (L. delbrueckii)のゲノム情報からVB12定量に利用可能と考えられるribonucleoside reductase (RNR)をコードする遺伝子を探索し、RNR遺伝子をクローニングした後、大腸菌にHis-tag付加RNR (His-RNR) を導入し、作出した組換え大腸菌を大量培養し、菌体破砕液からHis-RNRをHis-trapカラムを用いて精製する事を目的として研究を遂行した。
この結果、L. delbrueckiiのゲノム上に補酵素としてVB12を要求するタイプ (RNR class Ⅱ) のRNR (locus_tag="LL717_08245") 及びribonucleoside-triphosphate reductase activating protein (RAP) (locus_tag="LL717_08240") がクラスターを組んでいる領域を発見した 。そのため、RNRのみをターゲットとする予定であったが、RAPについてもHis-RAP大量発現系を構築し精製し、VB12の酵素学的定量法に与える影響を検討することとした。
本年度は、His-RNR及びHis-RAP遺伝子をベクターに導入し、大量発現系の構築が完了した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本研究計画は計3段階の構成となっており、第１段階ではVB12定量を目的としたRNR活性測定法の検討を行う、としたが想定以上にRNR活性の測定についての論文が充実していたため、RNRを精製することでRNR酵素活性を指標としたVB12定量が速やかに遂行可能であるとの確信を得た。
そこで現在は第２段階のHis-RNR大量発現系の構築を進行中であり、概ねスムーズに進行している。また、本来の計画にはなかったHis-RAPについても大量発現系の構築を行っている。
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| 今後の研究の推進方策 |
本年度中にHis-RNR及びHis-RAPの精製を完了し、両タンパク質を用いてVB12標準品の酵素学的定量法について検討を行う。最終年前半に食品中でのVB12の酵素学的定量法についてのバリデーションを行い、論文化を目指す。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
概ね予定通りの執行となったが、資料収集にあたって無料公開された論文等が想定より多く、予定されていた書籍・論文費が残余として生じた。
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