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本研究ではキク矮化ウイロイド（CSVd）感受性品種であるキク‘ピアト’にCSVdを接種し，その後の感染配列の変化を調査していく．単系統のCSVdを接種するために接種源としてin vitro転写したRNAを用いる予定であり，まずはこのRNAを用いた効率的な接種系を確認した．濃度調整したウイロイドRNAを，ペンチあるいはカーボランダムと綿棒を用いた機械的接種に用いたところ，ペンチを用いた時に良好な感染率（92％）を得た．次に，感染配列から変異系統を抽出する手法を検討した．接種1か月後に感染株の上位葉からRNAを抽出し，サンプル中のCSVd配列をRT－PCRによって増幅・クローニングした．クローニングした配列をGCクランプを付加したプライマーを用いたPCRによって増幅し，温度勾配ゲル電気泳動システムを用いたヘテロデュープレックス解析により感染配列を調査した．この結果，調査した32クローンの中から，接種に用いた配列とは異なるバンドパターンを示す増幅産物を4種得た．これらの配列をサンガーシーケンスにより確認すると，それぞれ接種に用いた配列とは1あるいは2塩基の相違を持つCSVd配列であることがわかり，本手法によりCSVdの変異系統を1塩基レベルでスクリーニングできることを確認した．なお，2019年度春に研究代表者の所属機関異動があったが，実験に用いる‘ピアト’CSVdフリー株はin vitro培養にて継代し，無事に移動した．現在はin vitroにおいて増殖を進めているところであり，2019年度夏季から圃場に定植できる予定である．
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