| 研究課題/領域番号 |
18K14471
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| 研究機関 | 金沢大学 |
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研究代表者 |
國生 龍平 金沢大学, 生命理工学系, 研究協力員 (90756537)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | 宿主操作 / バキュロウイルス / カイコ / BmNPV / GAL4-UAS / ゲノム編集 / 中枢神経系 |
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| 研究実績の概要 |
バキュロウイルスに感染したチョウ目昆虫の幼虫は異常な徘徊行動を呈する。この現象はウイルスによる利己的な宿主操作であると考えられている。これまでの研究から、バキュロウイルスは宿主の脳に感染することで直接的に行動中枢を操作していることが示唆されたが、その直接的な証拠はいまだ得られていない。そこで本研究課題は、ウイルスゲノムをターゲットにしたCRISPR/Cas9システムとGal4/UASによる遺伝子発現誘導システムを組み合わせることで、宿主行動操作における脳感染の重要性を実証し、行動操作に重要な脳領域を絞り込むことを目標とする。
初年度であるH30年度は、実験材料である遺伝子組換えカイコおよびバキュロウイルスの作出に注力した。まず、5xUASの制御下でCas9遺伝子を、カイコU6プロモーターの制御下でウイルスの必須遺伝子をターゲットにしたsgRNAを発現するドナーベクターを作出した。このドナーベクターを用いてpiggyBacトランスポゼースによる遺伝子組換えを行うため、当該ベクターをカイコ卵にインジェクションした。一方、当初利用予定であったエンハンサートラップGal4系統が本実験の目的に足る発現パターンを示さないことが判明したため、現在TAL－PITCh法により中枢神経系解析用のGal4系統を作出中である。また、脳におけるウイルス感染領域の変化をイメージング解析するため、感染ステージ特異的にGFPやmCherryなどの蛍光タンパク質を発現する組換えバキュロウイルスを作製中である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
平成30年度は、遺伝子組換えカイコおよびウイルスの作出が主要な達成目標であったが、遺伝子組換えカイコの作出の進捗状況が想定よりもやや遅れている。
第一の原因は、インジェクション用系統の変更である。当初は予備実験により徘徊行動の観察に適したw1-pnd系統を用いて組換えカイコを作出を幾度も試みたが、この系統は最適なインジェクション条件を整えてもなお卵の孵化率が約5%程度と非常に低かったため、組換え体を得るのが非常に困難であることが判明した。一方、N4系統では30~60%という高い孵化率を達成できたため、インジェクション用系統をN4に変更した。しかし、N4系統は徘徊行動の観察に適さないため、白c系統との戻し交配を行わなければならず、その点でも当初の予定より余計に時間がかかってしまうと予想される。
第二の原因は、Gal4系統の新規作出が必要になった点である。当初はナショナルバイオリソースプロジェクトにより九州大学で管理されているエンハンサートラップGal4系統を用いて実験を進める予定であったが、実際に取り寄せて発現パターンを調査した結果、本研究の要求を満たさないことが判明した。そこで、本研究で用いるためのGal4系統を新規に作出するため、TAL-PITCh法により目的の発現パターンを示す遺伝子領域にGal4をノックインすることを試みている。
一方、上述の問題点は既に解決済であることから、今後は平成30年度よりも効率的に組換え体を作出でき、それらを用いたDEGの機能解析に進む事ができると考えている。
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| 今後の研究の推進方策 |
初年度は主要な実験材料である遺伝子組換えカイコの系統樹立までは至らなかったものの、インジェクションにおける低孵化率の問題は解決したため、今後は組換えカイコ系統を最優先で作出し、それらを用いて脳感染の重要性の実証を行う予定である。特に、ショウジョウバエにおいて神経細胞特異的遺伝子としてよく用いられるelavやnSyb、頭部特異的遺伝子として用いられるotdといった遺伝子のカイコホモログについてGal4系統の作出を遂行する。また、20xUAS-Cas9やFRT配列を持つ改良型のドナーベクターを現在作製中であり、これを用いて作出した組換えカイコにFLP/FRTシステムによるコンディショナルノックアウトを適用することで、行動操作に必要な脳領域を絞り込む予定である。
また、別のアプローチとして、ウイルスのlef-8遺伝子に1アミノ酸置換を導入することにより、33℃以上の高温で増殖能を失った温度感受性ウイルスを現在作製中である。このウイルス感染幼虫の体を局所的に温度操作することで、ウイルス増殖を局所的に制御し、行動操作に重要な組織を特定できると考えている。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
平成30年度の助成金使用において物品を予定よりも安価に購入する事ができたため、若干の余剰が生じた。次年度の支払い請求予定額は今年度よりも少額であるため、この余剰分（次年度使用額）を物品費として次年度の消耗品購入に充てる予定である。
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